一、胶体金的一般性状(一) 胶体金的颜色溶胶的颜色取决于分散相物质的颜色、分散相物质的分散度和入射光线的种类，是散射光线还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短。

对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，呈现的颜色亦不同。

如胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红色的葡萄酒色；20～40nm之间的金溶胶主要吸收波长530nm的绿色光，溶液呈深红色；60nm的胶体金溶胶主要吸收波长600nm的橙黄色光，溶液呈蓝紫色。

一般应用于免疫组织化学的胶体金颗粒为5～60nm范围内，溶液呈现红色。

在相当的一段时期内保持其溶胶不变性，称为胶体金的稳定性。

影响其稳定性的因素主要是电解质，其次是胶体金本身的浓度、温度及其他非电解质等。

(二) 胶体金的稳定性溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散相之间，其颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。

然而，溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总面积较大、因在胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。

当胶体颗粒直径变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。

影响其稳定性的主要原因有三点。

(1) 胶粒间的相互吸引力当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶体颗粒合并而变大。

(2) 胶粒及其溶剂化层胶粒及其溶剂化层(溶剂是水时就是水化层)的带电情况。

一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。

同性电荷相斥，双电子层变厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。

(3) 胶体接口的溶剂膜当二个固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。

两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。

(三) 溶胶的聚沉现象胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶胶粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。

因为某种原因使溶胶粒带电量减到很小，甚至中和其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。

引起溶胶聚沉的原因有。

(1)少量电解质对溶胶的聚沉作用少量电解质即可使溶胶聚沉，但各种电解质的聚沉能力可用聚沉值来表示。

聚沉值是在一定时间内使1L某浓度的溶胶产生聚沉所需电解质的最小物质的量(mm01)。

显然，聚沉值愈小，聚沉能力愈大。

聚沉值从实验中得出如下的规则：①电解质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用；②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价增加而显著增加。

电解质能使溶胶聚沉是由于电解质与胶粒带相反电荷离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电子层厚度缩至很小和溶剂化层变得很薄时，两个质粒间便可以更加接近，即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。

胶粒的双电子层结构图(2)温度对溶胶稳定性的影响一般影响不大。

当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加。

(3)浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度。

二、胶体金制备前的准备制备胶体金的方法很多，其中应用较为广泛的是还原法，而分散法和其他凝聚法都不合乎要求。

还原法的基本原理是在氯化金溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。

在医学研究中最常用的还原剂有白磷、乙醇、过氧化氢、抗坏血酸、硼氢化钠、柠檬酸钠及鞣酸等。

本节将重点介绍应用上述还原剂制备胶体金的具体方法和步骤，还可根据各实验室的条件及所需合成颗粒的大小，来选择合适的方法。

现将常用的几种方法介绍如下：①白磷还原法(Isigmondy，1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒；②白磷还原法(1sigmondy 及IsigmondyThiessen，1925年)经改良后，可合成5～12nm大小的金颗粒；③抗坏血酸还原法(Statis和Fabrikanos，1958年)可合成6～13nm大小的金颗粒；④柠檬酸三钠还原法(Frens，1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金颗粒；⑤乙醇—超声波还原法(Baigent和Muller，1980年)可合成6～10nm大小的金颗粒；⑥硼氢化钠还原法(Trchopp 等，1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒；⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(Slot等，1985年)可合成3～17nm大小的金颗粒。

作者实验室主要用单宁酸—柠檬酸三钠还原法、柠檬酸三钠还原法及硼氢化钠还原法，主要根据合成颗粒大小来选择。

(一)玻璃器皿的清洁还原法可以认为是重结晶过程，颗粒的大小取决于结晶核形成的速度及结晶核生长的速度。

因此，用于制备胶体金的玻璃器皿应绝对清洁。

因为玻璃表面性状对还原过程的启动有重要作用，少量的污染会影响胶体金的生成，造成颗粒大小不一或液体浑浊。

处理方法是将玻璃器皿清洁晾干后，人清洁液内浸泡24h，取出后依次用自来水和蒸馏水洗净，凉干，硅化，也可不经硅化。

第一次生成胶体金稳定玻璃器皿表面，然后弃去，再用蒸馏水洗后即可再用。

最好是所有的玻璃器皿专用化，以减少污染。

玻璃器皿表面应无明显的划痕，否则也会影响胶体颗粒的均一度。

(二)试剂的配制要求(1)配制试剂均用双蒸馏水或三蒸馏水，或用去离子水。

(2)氯化金水溶液的配制氯金酸(AuCl3·HCl)每支为1g装，用时用蒸馏水一次全部稀释成l％水溶液，呈现黄色的透明状，应无任何沉淀，未用完部分可保存在4℃冰箱内，长期使用。

(3)SPA纯晶、特异性抗体或第二抗体必须经亲和层析，琼脂免疫双扩散效价为1：64以上才可选用，其他蛋白及受体也需高度纯化。

(4)白磷或黄磷乙醚溶液的配制白磷在空气中易燃烧，操作时要小心。

把白磷放在蒸馏水中切成小块，放在滤纸上吸干水分后，迅速放入已准备好的乙醚中，轻轻摇动，等完全溶解后即得到饱和溶液，并贮藏于棕色密闭瓶内，阴凉处保存。

(5)其他试剂配制后最好用一定规格的超滤膜过滤，以去除大分子聚合物。

三、白磷还原法制备胶体金分散颗粒胶体金可用多种方法制备，其中应用较为广泛的是化学还原法。

这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子，可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但在生物医学领域内最为常用的还原剂是白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸等。

白磷还原法的建立已有近百年的历史，由于此法操作较为简便，制备出来的胶体金颗粒大小较一致，因而应用较为广泛，现以Faulk和Taylor(1971)的报道为基础介绍这一方法。

(1)取1％氯化金1.5mL、0.1mol／LK2CO3 1.2mL，加入120mL双蒸水。

(2)上述溶液充分搅拌混匀3min以上。

(3)在搅拌条件下将lmL新鲜配制的20％饱和白磷乙醚溶液加入上述混合液中，约在5min内溶液变为棕红色。

(4)将上述混合液加热煮沸，直至变成鲜明的橙红色为止，一般约需l0min。

橙红色的出现表明氯化金的还原反应终止，胶体金制备成功。

按上述法制备的金颗粒直径为(5.6土0.9)nm。

白磷还原法一般只能制备出单一颗粒直径的胶体金。

因此，用于电镜双重标记或多重标记时此法显得有些不足，还需结合其他方法。

Henegouwen等(1986)发展了传统的白磷还原法，可制备出多种不同直径的胶体金，取得了良好的效果，具体方法如下。

(1)取0.5mL新鲜配制的20％饱和白磷乙醚溶液，加入到60mL用上述方法制备的胶体金中(5.6nm土0.9nm)充分振摇5min以上。

(2)将1％氯化金0.75m1及0.1mol／LK2C030.6mL加到上述溶液内，振摇数分钟溶液变成棕红色。

(3)将上液煮沸加热，直至变成鲜明的红色，一般需l0min。

上述还原过程使胶体金颗粒直径增大，随着还原次数的增加，胶体金颗粒的直径亦越来越大，二者之间的关系见表。

胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系(白磷还原法)还原次数颗粒直径/nm SD0 16 0.91 6.7 0.92 7.9 0.94 9.8 1.35 12 1.0这一方法的特点是通过循环还原的引入使原白磷还原法的适用范围得到扩大，其次，在循环还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒，而只与原先的金颗粒结合，使它直径变大。

原先加人的胶体金颗粒起着“晶核”的作用。

因此可以利用这一方法制备出一系列颗粒直径不同但具有相同颗粒密度的胶体金来。

四、柠檬酸钠还原法制备胶体金分散颗粒柠檬酸钠还原法(Frens，1973)制备过程十分简单，制备出的金颗粒均匀一致，因此广为采用。

取0．01％氯化金溶液l00mL加热至沸腾，迅速加入4mL 1％柠檬酸钠水溶液，可见溶液很快变蓝，然后继续加热至溶液由蓝变为橙红色为止。

通过改变柠檬酸钠的用量可以制得不同颗粒大小的胶体金，因而显得十分方便。

各种颗粒的胶体金制备详见表。

柠檬酸钠用量与胶体金颗粒直径的关系0.0l%氯化金用量/m 1%柠檬酸钠用量/mL 胶体金颗粒直径/nm50 2.00 10.050 1.50 15.050 1.00 16.050 0.75 24.550 0.50 41.050 0.30 71.550 0.21 97.550 0.16 147.0表并不表明按照Frens法只能制备出上述几种颗粒的胶体金，大量研究已表明该法制备胶体金时，颗粒的大小是柠檬酸钠用量的函数，即在一定的范围内任意给定一个柠檬酸钠的量，总有一定大小的胶体金颗粒与它相对应，因而这种方法可很好地满足电镜双重标记和多重标记的要求。

五、制备胶体金分散颗粒的其他方法（一）乙醇—超声波还原法(Baigent和Muller，1980)(1)取1％AuCl3·HCl水溶液lmL加入100mL双重蒸馏水。

(2)用0.2m01/LK2C03调pH至7.2，再加入lmL无水乙醇。

(3)用20KC、135W超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，此法制备的颗粒为6-10nm。

硼氢化钠还原法(Tschopp等，1982)(1)取0.6mL 1％氯化金水溶液，加入40mL预冷(4℃) 双蒸馏水。

(2)再加入0.2mol/LK2C030．2mL。

(3)边搅拌边加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液(0.5mg/m1)2mL，至溶液由蓝紫色变为橙红色为止。

然后继续搅拌5min，获得的金颗粒直径在2-5nm之间。

（二）放射性胶体金制备法(Kent等，1981)(1)取0.01％AuCl3·HCl水溶液100mL，加热至沸腾。

(2)加入40ul195Au。

(3)迅速加入4mLl％柠檬酸三钠水溶液，搅拌5-7min，至出现透明的橙红色。