差异点分析 检测
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抗体免疫印迹法
优点
灵敏 直观
克服同位素法的局限
无同位素污染，操作相对方便 可检测无磷酸化转换的蛋白 能区分不同残基的磷酸化
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磷酸化肽段的分离和富集
使用磷酸化蛋白的抗体 IMAC法 磷酸基团亲和取代
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磷酸化蛋白的抗体
蛋白质组学
浙江大学 生命科学学院
江辉
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第五章 蛋白质 翻译后修饰的鉴定
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2
蛋白质的翻译后修饰
很多前体蛋白是没有活性的，常常要进行一个系列 的翻译后加工，才能成为具有功能的成熟蛋白。
加工的类型是多种多样的，一般分为四种：
N-端fMet或Met的切除：原核生物的肽链，其N-端不保 留fMet，大约半数蛋白由脱甲酰酶（deformylase）除去 甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；在原核及真核细 胞中fMet或者Met一般都要被除去
二硫键的形成
化学修饰
剪切：很多的前体蛋白要经过剪切后方可成为成熟的蛋 白 ，如胰岛素
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蛋白质的翻译后化学修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作 用，它使蛋白质的结构更为复杂, 功能更为完善， 调节更为精细, 作用更为专一。
化学修饰的类型也很多，包括磷酸化（如核糖体 蛋白的Ser，Tyr和Trp残基常被磷酸化）；糖基化 （如各种糖蛋白）；泛素化（要进入蛋白酶体降 解的蛋白）；甲基化（如组蛋白，肌蛋白），乙 酰化（如组蛋白），羟基化（如胶原蛋白）等。
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翻译后化学修饰的生物学效应
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA 修复、免疫应 答和应激反应等生理过程起着重要作用;
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩 以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程;
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复 制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用;
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关 键的作用;
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。
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蛋白质组学如何在翻译后 化学修饰中发挥作用？
磷酸化 糖基化
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蛋白质磷酸化
磷酸化是通过蛋白质激酶将ATP 的磷酸基转移到蛋 白的特定位点上的过程.
Protein + ATP 激酶 protein-P + ADP
利用了磷酸基团的负电性，与IMAC柱上的带正电的金属 离子结合，从而起到纯化的作用。
IMAC技术对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化都有效 IMAC技术使用的金属离子主要是Fe3+、Ga3+ 、Cu2+等 最主要的缺点是特异性不强：IMAC柱上的正电荷位点同
样会与肽段中的天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基结合
细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处理时，这 些酶很容易将磷酸基团脱掉；
磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其 化学性质的负电性，在质谱技术中面临着难 以质子化的困难。
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磷酸化蛋白质的检测
32P放射性同位素法 抗体免疫印迹法
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32P放射性同位素法
-32P-ATP渗入培养 蛋白样品的制备 双向电泳 检测
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以-干酪素做测试
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磷酸肽的识别
MALDI－TOF－MS结合磷酸酶水解法 磷酸酯酶处理蛋白质的前后，磷酸化肽段的质量数会有变化，比较 前后图谱，寻找质量数变化80或98Da和强度增大的信号就很可能是 磷酸化肽段。 丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段的质量变化可能是80Da，也可能是98Da； 酪氨酸磷酸化肽段只有80Da的质量数变化
考染或者银染 放射自显影
差异点分析 检测
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autoradiography
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放射性同位素法
优点
灵敏 直观
局限
同位素污染，操作不方便 若磷酸化转换速率低，则难以检测 不能区分不同残基的磷酸化
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抗体免疫印迹法
蛋白样品的制备 双向电泳 检测
考染或者银染 免疫印迹（磷酸化特异抗体）
目前已经开发出针对 特异磷酸化位点的单 克隆抗体，-pTyr， -pSer， -pThr
利用这些单克隆抗体 进行亲和纯化，可以 分离
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固定金属鳌和亲和层析(Immobilized
metal affinity chromatography ，IMAC)
IMAC技术是用于富集磷酸化的肽段，对磷酸化蛋白质的 富集是无效的。
对磷酸化肽段中的酸性残基进行了预先的甲基酯化，封闭了上述 氨基酸的酸性侧链。
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IMAC
填料－交联剂－金属螯合剂－金属离子
MS
MS/MS
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磷酸基团亲和取代
将磷酸肽上的磷酸基团用另一种配基取代， 再用亲和纯化的方法分离富集磷酸肽
生物素取代
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生物素取代
细胞膜的许多蛋白质是以糖蛋白形式存在 糖低聚物在细胞间信号传递中也起了重要的作用 成为免疫系统调控和癌症治疗的最重要的线索之一
序列和磷酸化位点。 磷酸化位点产生丢失80kD或者98kD的子离子。
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糖基化的蛋白质组学研究
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糖基化蛋白的生物学意义
在真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化
蛋白质糖基化在蛋白质折叠、蛋白质定位和转运、 蛋白质溶解性、抗原性以及细胞与细胞的相互作用 等方面都有着重要的作用
至少有30%的蛋白被磷酸化修饰
大部分蛋白磷酸化是可逆的
磷酸化的作用位点
真核生物的Ser，Thr，Tyr 残基.
原核生物的His，Asp，Glu
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蛋白质组学在磷酸化分析中的困难
磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较 低丰度的；
即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排 除有该蛋白质的其他磷酸化形式存在；
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PSD－MALDI－TOF－MS
PSD：源后衰变（post-source decay），母离子在飞行中发生断裂，丢 失一个中性分子。磷酸化肽段丢失HPO3或者H3PO4，产生质量数减少 80kD或者98kD的子离子。
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磷酸化位点的确定
用串联质谱（MS/MS）对磷酸化肽进行分析。 将磷酸化肽打碎，产生全部碎片离子，根据离子数量推断肽