分子生物学与生物化学课程论文酶联免疫（ELISA）检测方法学院:山西农业大学信息学院系部:农业与生命科学系专业:生物技术班级:102班学号:2010010229姓名:高淼时间:2013年5月5日酶联免疫（ELISA）检测方法摘要：酶联免疫法简称ELISA，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
关键词：ELISA基本方法抗体抗原前言：1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)。
ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。
尽管早期的ELISA 由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。
一、基本原理将抗原或抗体结合到某种固相载体，并保持其免疫活性，将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留酶的活性，也不会改变抗体的免疫学特性。
而常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AKP)等。
①在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应；滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
二、其原理的免疫学基础抗原、抗体：抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。
抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。
Ig 分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD 和IgE。
与免疫测定有关的Ig 主要为IgG 和IgM。
②抗原抗体反应：抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，具有特异性、可逆性、敏感性3个重要性质。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP 应用最广。
1、辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18％），分子量约40000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。
此酶溶于水和50％饱和度以下的硫酸铵溶液。
酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm 和403nm。
辣根过氧化物酶催化反应对Ｈ２Ｏ２具有很高的专一性。
在ＨＲＰ催化荧光分析中讨论荧光底物的结构，将有助于揭示酶催化反应机一，对提高分析方法，灵敏度将有着极其重要的应用价值和深远意义。
③2、碱性磷酸酶系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。
它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。
酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。
酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg 磷酸苯二钠为一个单位。
④AP 也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
三、基本方法ELISA 的分类至今尚无统一的标准。
有些学者根据有关的交献,提出以下三种常用的测定方法（1）测定抗体的间接法；(2)测定抗原的双抗体夹心法；(3)测定抗原的竞争法。
⑤1、间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下⑥：⑴将抗原包被在固相载体上，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵若样品中含有抗体，则结合为抗原-抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。
其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
⑶再加入酶标二抗体，则结合为抗原-抗体-酶标抗体复合物，洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
⑷酶催化底物并显色，颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。
虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
2、双抗体夹心法测定抗原双抗体（原）夹心法检测抗原（体）的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的⑦两种单抗分别作为固相载体和酶标抗体检测溶液中的抗原。
操作步骤如下：⑴将抗抗体包被在固相载体上，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。
⑵如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物，洗涤除去其他未结合的物质。
⑶加入抗原及酶标抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标抗体复合物，彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
⑷酶催化底物并显色，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，（适用于二价以上抗原,不能测小分子半抗原）例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等⑧。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。
如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体。
3、竞争法检测抗原或小分子半抗原、抗体，以测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。
标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。
操作步骤如下：⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
洗涤。
⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。
如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。
如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。
参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。
洗涤。
⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。
另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。
抗HBe的检测一般采用此法。
四、注意事项：在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：⑴固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。
目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
⑵包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。
吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃18～24小时。
蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。
选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。
对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。
⑶酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定；然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
⑷酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。
有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。
底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。
通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。
底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
五、前景ELISA是一种非均相的酶免疫检测技术，具有敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域⑨。
ELISA的影响因素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。
测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。
目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。
参考文献：①ELISA在食品动植物及其产品安全检测中的应用《口岸卫生控制》2003年第5期孙永江任立新②王重庆,分子免疫学基础,北京:北京大学出版社,1997③辣根过氧化物酶催化反应在荧光分析中的应用《天津化工》1999年第3期杜建云唐波④碱性磷酸酶辣根过氧化物酶结合物在包虫病Elisa中对比应用李华苏东明温博贵《江西医学院学报》1988年01期⑤细胞-酶联免疫吸附试验及其应用[期刊论文]《检验医学》ISTIC PKU-2006年z1期朱晴晖⑥生物技术概论，周选国，第七章，生物技术与食品，食品检测⑦临床输血与检验>2001年4期>双抗原夹心法与间接法检测抗-HIV(1+2)的比较⑧Reen DJ.1994.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Methods Mol Biol.32:461-6.⑨李金明．定量聚合酶链反应技术．中华检验医学杂志，2002（2），123。