酶联免疫反应
均相酶免测定的对象为小分子抗原或半 抗原,主要用于药物测定。可以直接用 于全自动生化分析仪测定。
非均相酶免疫分析法(heterogeneous enzyme immunoassay) 常用的酶免疫分析 法多为非均相法,又可分为液相酶免疫法和 固相酶免疫法两种,以后者最常用,称为酶 联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。ELISA是 临床上最常用的免疫分析方法。需经过结合 的标记物和游离的标记物的分离才能测定. 分离的方法主要通过固相载体吸附后清洗未 结合的游离标记物。
环 境 因 素
通风、采光与防尘。 控制温度及湿度, 环境温度与湿度随地理位 置不同可有很大差异应使用系统空调进行控 温, 并要求控制空气湿度为40%~70%之间 消除噪音与电磁干扰。 稳定水电, 实验过程中应采用蒸馏水(纯水) 或经软化处理的自来水。
六、ELISA应用
ELISA在饲料安全检测中的应用
固相抗原或抗体
1、固相载体的性状 固相载体在ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器,不 参与化学反应。 ELISA 载体的形状主要有:膜(NC膜、PVDF膜、尼 龙膜)、微量滴定板(96孔板)、小珠和小试管,以 微量滴定板(96孔板)最为常用。 良好的ELISA 用96孔板应该是吸附性能好,空白值低, 孔底透明度高,各板之间、同一板各孔之间性能相近。 2、包被用抗原 用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗 原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 3、包被条件
酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
双抗体夹心法
竞争法
间接法
ELISA基本实验过程 包被:将已知抗原或抗体通过物理吸附 到固相载体表面,使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应:先后加入被检标本和酶 结合物,使之与固相抗原或抗体发生免 疫反应而被结合固定 酶促反应:在反应体系中加入酶作用的 底物,使发生酶促反应而显色
ELISA既可以测定抗原,也可以测定抗体。 根据测定对象不同,可采用不同的模式,主 要有双抗夹心法、间接法和竞争法等。
一、ELISA简介
二、ELISA原理 三、ELISA分类 四、ELISA相关试剂 五、ELISA影响因素
六、ELISA应用
一、ELISA简介
•1971年瑞典学者 Engvall和Perlmann,荷兰学 者Van Weeman和Schuurs分别报道将免疫技术 发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方 法,称为酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)。 •自上世纪70年代初问世以来, ELISA发展十 分迅速,目前已被广泛用于生物学和医学科学 的许多领域。
酶标记的抗原或抗体(结合物)
1、酶 用于ELISA 的酶应符合以下要求: (1)纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质 稳定,来源丰富,价格不贵; (2)制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催 化能力; (3)在受检标本中不存在相同的酶; (4)相应底物易于制备和保存,价格低廉; (5)有色产物易于测定,光吸收高。 常用的酶为辣根过氧化物(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase,AP)。
②酶标记的抗原或 抗体(标记物)
③酶作用的底物(显色剂)
①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)
加样本
振荡、洗板
入酶标记得抗原
酶 标 记 物
轻链 螯合剂
辣根 过氧 化物 酶
V
重链
振荡、洗板
加入底物显色液
三、ELISA分类
免疫标记技术
放射物标记技术 酶标技术 免疫荧光技术 其他标记技术
酶联免疫吸附技术
实验中对照的设置
阳性对照 阴性对照 空白对照 临界标准品
ELISA试剂
(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附 剂); (2)酶标记的抗原或抗体(结合物); (3)酶的底物; (4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中), 参考标准品和控制血清(定量测定中); (5)结合物及标本的稀释液; (6)洗涤液; (7)酶反应终止液。
ELISA在疾病诊断中的作用
ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用 检测抗异质性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2 )/类风湿性关节炎(PtA)33抗体
ELISA法检测幽门螺杆菌抗体
二、ELISA原理
•ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体 的酶标记。 •结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学 活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性, 又保留酶的活性。 •在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记 的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的 比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有 色产物,产物的量与标本中受检物质的 量直接相关,故可根据呈色的深浅进行 定性或定量分析。
酶联免疫反应
概述
免疫分析:是以抗原抗体相互结合的免疫反应 为基础,研究免疫学技术及其在医学领域中 的应用。
免疫分析的分类 根据分析过程中是否需要标记物可分为两类 一、标记免疫分析:根据标记物的种类可分为 1、酶免疫分析 2、放射免疫分析 3、发光免疫分析 4、荧光免疫分析 5、金(银)免疫标记分析
五、ELISA影响因素
试剂因素 标本因素 实验原理或操作方法 环境因素
试 剂 因 素 抗原抗体的纯度 标准品定值的准确性 抗体的亲和力、滴度和特异性 标记物的比活性或免疫活性
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标 本 Байду номын сангаас 素
内源性物质常见的有: 类风湿因子(RF)、嗜异性抗 体(Id)、补体、人抗动物抗体(HAAA)、药物及 其导致的代谢产物和交叉反应物质等。 外源性物质主要为:标本溶血、标本细菌污染、标本 储存时间过长、标本凝集不全和采血管中含有添加剂 等。 自身免疫产品:胆红素浓度小于0.05mg/mL的黄疸, 血红蛋白浓度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯浓度 小于25.0mg/mL的脂血对检测结果没有影响。
实验原理或操作方法 钩状效应(HOOK效应)及交叉反应 现象 颜色终止条件
ELISA实验终止剂选用引起的持续发展的颜色加深 影响了阴性和弱阳性样品及定量检测样品的结果, 特别在大批样品需较长时间进行读数时, 这种潜在 的颜色逐渐加深现象成为结果影响的重要因素。
ELISA的洗板过程
洗液冲力过大会造成酶结合物丢失, 本底偏浅, 吸光 度值偏低, 且洗板后残留液规定一般不超过2ul。
二、非标记免疫分析: 免疫沉淀实验、免疫浊 度分析技术
一、酶免疫分析:是利用酶的高效催化和放大 作用与特异性免疫反应结合而建立的一种标 记免疫技术。 原理: 用酶标记的抗原(或抗体)用于免疫反 应,并以相应的底物被酶分解的显色反应对 样品中的抗体(或抗原)进行定位的分析和 鉴定。
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物可 分为可分为非均相(或异相)酶免疫测定和均 相酶免疫测定两种方法 。 均相酶免疫分析法(homogeneous enzyme immunoassay,HEI)是在检测过程中抗原 抗体反应后,无需分离结合和游离酶标记物, 直接根据反应前后酶活性的改变进行待测物 质的测定的分析方法。 均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术 和克隆酶供体免疫测定两种方法。
酶的底物
1、HRP 的底物 HRP 催化过氧化物的氧化反应,常用的供氢体有邻苯 二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 TMB 经HRP作用后共产物显蓝色,目视对比鲜明。 TMB 性质较稳定,可配成溶液试剂,无致癌性等优点。 酶反应用HCl或H2SO4 终止后,TMB 产物由蓝色呈黄 色,可在比色计中定量, 2、 AP 的底物 AP 为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯(p‐NPP) 作为底物。 产物为黄色的对硝基酚,用NaOH终止酶反应后,黄色 可稳定一时间。 NBT/BCIP,紫色反应,水冲洗终止反应。
饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定(主要包括黄曲霉毒素, 简曲霉毒素 ) 饲料中有害微生物的快速筛检 (如沙门氏 菌 )
ELISA用于农药残留的检测
甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析
农药的检测
主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松( FN )、 甲氟磷酸异已酶( SOMAN )、 草不绿( Alachor )、 西维因( Carbaryl )、 多菌灵及克菌丹( Captan )等。 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 河豚毒素 苯并芘