第二十二章
基因结构与功能分析技术
The Analysis Technology for Gene Structure and Function
目录
DNA序列测定 基因转录起点及其启动子的分析 基因编码序列的分析 基因拷贝数及其表达产物的分析 基因功能获得和/或缺失策略 随机突变筛选策略
目录
第一节 基因结构分析技术
模板基因拷贝数
DNA测序：最精确鉴定基因拷贝数
目录
第二节 基因表达产物分析技术
目录
一、转录水平分析（RNA分析）
根据分析方法的原理和功能特性，可分为：
封闭性系统研究方法： DNA芯片 （仅限于已知基因） RNA印迹
实时RT-PCR等
开放性系统研究方法：差异显示PCR （用于分析未知基因）双向基因表达指纹图谱
（一）用PCR结合测序技术分析启动子结构
根据启动子序列
最简单和直接
设计一对引物 PCR法扩增启动子 测序，分析启动子序列
目录
（二）用核酸-蛋白质相互作用技术 分析启动子结构
1. 足迹法 分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点
足迹法（footprinting）：利用DNA电泳条带 连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA 区域。
目录
（二）全自动激光荧光DNA测序技术
——原理基于Sanger双脱氧法
1. 单色荧光法：
2. 四色荧光法：
单一荧光染料
标记
引物5′-端或dNTP
所有DNA片段均 带同一种荧光标记
4种不同荧光染料
标记
同一引物或4种 不同ddNTP
4种不同颜色DNA片段
样品的4个反应产物分别 在4个不同泳道内电泳
样品的4个反应产物可在 同一个泳道内电泳
目录
（三）焦磷酸测序—— 基于发光法测定焦磷酸 的测序技术
反应体系：
5’磷酸化硫酸腺苷（APS） 底物 荧光素
DNA聚合酶
酶
ATP硫酸化酶 荧光素酶
ATP双磷酸酶
剩余的被 降解
ppi 某种dNTP
（每轮加入)
目录
（四）循环芯片测序——第二代测序技术
cyclic-array sequencing 优势： ① 可大规模并行化分析
高通量分析RNA剪接的方法：
① 基于DNA芯片的分析法：外显子或交界DNA芯片 ② 交联免疫沉淀法：Pr-RNA交联→特异抗体沉淀→分析RNA ③ 体外报告基因测定法：报告基因克隆到载体，若表达，
说明RNA有剪接
目录
（三）用数据库分析基因编码序列
在数据库中，对获得的cDNA序列进行：
同源性比对 染色体定位分析 内含子∕外显子分析 ORF分析 表达谱分析
逆转录
cDNA第一链
逆转录酶(末端转移酶活性)
cDNA第一链末端加上polyC尾
合成cDNA第二链，获双链DNA
测序，获TSS序列
该方法比较简单，但依赖全长cDNA，若延伸不全 或被降解，可导致5-末端部分缺失
目录
（二）用5-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS
（三）用数据库搜索TSS
目录
三、基因启动子结构分析技术
① 核心启动子； ② 近端启动子：一般涉及TSS上游几百个碱基； ③ 远端启动子：范围涉及TSS上游几千个碱基， 含有增强子和沉默子等元件。
2. 预测启动子的其他结构特征
包括：GC含量 CpG比率 转录因子结合位点 碱基组成 核心启动子元件 等
Hale Waihona Puke 目录四、基因编码序列分析技术
（一）用cDNA法分析基因编码序列（一次能对几十万到几百万条DNA 分子进行测序）
② 不需电泳，设备易于微型化 ③ 样本和试剂的消耗量降低，降低成本
（五）单分子测序技术——第三代测序技术
目录
二、基因转录起点分析技术
转录起点（transcription start site，TSS）
（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS
mRNA模板
PCR（RACE）技术：可高效钓取未 知基因编码序列。
核酸杂交法：根据基因保守序列合成探针，对阳性克 隆的cDNA进行序列分析。
目录
（二）用RNA剪接分析法确定基因编码序列
选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序 列标签（expression sequence tag, EST）的比较 进行鉴定，但这种方法需进行大量变异体也很可能丢失。
分类： 酶足迹法 化学足迹法
目录
（1）用核酸酶进行足迹分析
利 用 DNA 酶 处 理 DNA- 蛋 白 质复合物，然后通过电泳分析蛋 白质结合序列。
常用的酶有DNA酶I（DNase I）和核酸外切酶III。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（2）用化学试剂进行足迹分析
用可切断DNA骨架的化学试 剂，处理DNA-蛋白质复合物。
形成仅相差1个核苷酸 的一系列DNA条带
目录
2. 电泳迁移率变动分析 染色质免疫沉淀技术 只能确定DNA序列中含有该蛋白结合位点 尚需结合DNA足迹实验和DNA测序等技术来
确定具体结合序列。
目录
（三）用生物信息学预测启动子
1. 用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子
在定义启动子或预测分析启动子结构时应包括启 动子区域的3个部分
分子索引法 随机引物PCR指纹分析等
目录
（一）用核酸杂交法
1. RNA印迹分析(Northern blot) 常用于RNA表达分析，并
作为鉴定RNA转录本、分析其 大小的标准方法。
2. 核糖核酸酶保护实验 （ribonuclease protection assay，RPA）
分析RNA水平及其剪接情况 基于杂交原理，既可定量分析，又可研究其结 构特征。
可初步明确基因的 编码序列，并对编码产 物的基本性质进行分析。
目录
五、基因拷贝数分析技术
分析基因的种类及拷贝数，即基因定性和定量 分析。常用的技术：
DNA印迹（Southern blot）：
根据探针信号出现的位置和 次数判断基因的拷贝数。若多个 拷贝成簇排列，应结合DNA测序 进行分析。
实时定量PCR：通过被扩增基因在数量上的差异推测
目录
一、基因一级结构解析技术
基因的一级结构：脱氧核苷酸的排列顺序 解析一级结构最精确的技术：DNA测序
（DNA sequencing）
目录
（一）双脱氧法和化学降解法 ——两种常规的DNA测序方法
Sanger双脱氧测序（dideoxy sequencing）法
目录
Maxam-Gilbert化学降解测序法