川芎内生真菌的分离与鉴定汪杨丽，严铸云，郭晓恒，宋杰，陈新，万德光成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075）E-mail：wangyangli27@摘要：目的：探讨川芎内生真菌类群与川芎品种和产地的关系。
方法：采用平板分离法分离川芎的内生真菌，采用点植法对分离菌株进行分类鉴定。
结果：从6个产地的川芎根茎样品共获得内生真菌50株，经形态观察分类鉴定为1纲、3目、4科、13属。
结论：不同产地及不同品种川芎的内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异，推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群有关。
关键词：川芎，内生真菌，分离鉴定川芎为伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功效，是著名的川产道地药材。
四川都江、彭州为川芎的主要产区。
此外，云南丽江、甘肃庄浪和华亭、江西等地也产，分别称“云芎”、“西芎”、“抚芎”[1～3]。
有关不同产地及不同品种川芎的化学成分品质、药理、药效的研究报道较多[4]，但至今未见从川芎根茎分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。
根据内生真菌和植物互惠共生的关系[5，6]，本文对不同产地及不同品种的川芎进行内生真菌的分离，探讨川芎在特定生境中的微生物群落结构的特征。
1. 材料与方法1.1材料1.1.1植物来源（见表1）1.1.2 培养基 PDA培养基[7]（马铃薯葡糖糖培养基）＋青链霉素混合液[8]（用于分离）；PDA 培养基；促孢培养基（KH2PO41g、KNO31g、MgSO4.7H2O 0.5g、KCl 0.5g、淀粉0.2g、葡萄糖 0.2g、蔗糖 0.2g、琼脂15～20g、蒸馏水 1000ml、PH自然)。
表1 各种川芎的样品情况药材名原植物部位采集地采集时间川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 根茎四川彭州敖平2006.5.20川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川都江堰石羊2006.5.22山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川彭州小鱼2006.7.24山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川汶川水磨2006.8.10西芎L. sinense Oliv. 根茎甘肃平凉市华亭马峡2006.9.14云芎L. chuanxiong Hort. cv. Jinxiong根茎云南丽江泸沽湖2006.8.17注：以上品种经成都中医药大学严铸云副教授鉴定1.2方法1.2.1. 内生真菌的分离先去掉新鲜川芎的须根，用自来水将川芎根茎表面洗净，用5%的NaClO溶液浸泡5min，用自来水反复的漂洗，稍干后切成适宜大小的小块，在无菌的条件下，用75％酒精中浸泡5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，然后用无菌刀片将表皮削去，分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块种植于PDA培养基内，每个培养皿中放7小块，每个样品6个培养皿，置28℃恒温箱中培养3～15d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围长出菌丝并渐渐形成菌落时，采用尖端菌丝挑取法把真菌转移到另一个PDA的试管斜面或者平皿纯化培养，即得内生真菌。
1.2.2内生真菌的鉴定采用插片培养法和点植法，利用光学显微镜对分离获得的川芎内生真菌进行显微形态（真菌菌丝和产孢结构）的观察、分类鉴定。
分类检索参照文献[9，10]。
2. 结果分别采集了川芎道地产区、非道地产区川芎和育苓区山川芎的根茎来分离内生真菌，分离获到内生真菌50 株，经微生物学形态观察，初步鉴定为3目、4科、13属，见表2。
由表2可知，内生真菌在川芎的根茎中广泛分布，在属的水平上呈现微生物的群落的多样性，其中镰孢属（Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、头孢霉属（Cephalosporium）为优势种群，分别占分离的内生真菌总数的28.0%、30.0%、14.0%。
从表3可看出，从不同品种及产地川芎根茎中都分离得到一定数量、不同类群的内生真菌，表明内生真菌在川芎根茎中普遍存在。
但是不同品种及产地川芎内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异。
表2 川芎内生真菌种群组成目(Order)科(Family)属(Genera)数量/株瘤座孢科（Tuberculariaceae）镰孢属（Fusarium） 14曲霉属（Aspergillus）15青霉属（Penicillium） 1头孢霉属（Cephalosporium）7沃德霉属（Wardonmyces） 1木霉属（Trichoderma） 1节枝孢属（Articulospora） 1轮枝孢属（Verticillium） 1拟小卵孢属（Ovulariopsis） 4丛梗孢科（Moniliaceae）隔指孢属（Dactylella） 2丛梗孢目(Moniliales)暗梗孢科 (Dematiaceae) 链格孢属（Sirodesmium） 1 黑盘孢目(Melanconiales) 黑盘孢科(Melanconiaceae) 棒盘孢属（Coryneum） 1 无孢目 (Mycelia Sterilia) 丝核菌属(Rhizoctonia) 1在属的水平上，13个属中以曲霉属（Aspergillus）和镰孢属(Fusarium)在各产地分布最广；道地产区与非道地产区比较，明显可见道地产区分离得到的内生真菌种群多样性更丰富，其中头孢霉（Cephalosporium）和拟小卵孢属（Ovulariopsis）为两道地产区的共有种群；两个育苓区中，曲霉属是共有种群，节枝孢属（Articulospora）和棒盘孢属（Coryneum）是彭州小鱼洞镇的特有种群，镰孢属(Fusarium)和木霉属（Trichoderma）是阿坝汶川水磨镇的特有种群，其他3个产地也有各自的特有种群，表明不同品种的川芎内生真菌群落在属的水平上具有专一性，可能内生真菌的生长受着两地生态环境中的海拔高度、气候等因素的影响。
虽然甘肃平凉市华亭马峡（2年生）和云南泸沽湖附近分离得到的内生真菌都属于镰孢属和曲霉属，但从内生真菌的数量可知，前者以曲霉属为优势种群，后者以镰孢属为优势种群。
表3 川芎内生真菌数量与种群分布产地属数量/株 合计/株头孢霉（Cephalosporium ）2 拟小卵孢属（Ovulariopsis ） 2 隔指孢属（Dactylella ） 2 轮枝孢属（Verticillium ） 1 彭州敖平镇 （道地产区）链格孢属（Sirodesmium ） 1 8 头孢霉（Cephalosporium ）5 曲霉属(Aspergillus ) 2 拟小卵孢属（Ovulariopsis ）2 镰孢属(Fusarium ) 1 都江堰石羊镇 （道地产区）丝核菌属 (Rhizoctonia )1 11 曲霉属(Aspergillus ) 1 节枝孢属（Articulospora ） 1 彭州小鱼洞镇 （山川芎） 棒盘孢属（Coryneum ） 1 3 镰孢属(Fusarium ) 3 曲霉属(Aspergillus ) 1 阿坝汶川水磨镇 （山川芎） 木霉属（Trichoderma ） 1 5 青霉属(Penicillium ) 1 镰孢属(Fusarium ) 1 甘肃平凉市华亭马峡 （1年生 西芎） 沃德霉属（Wardonmyces ）1 3 曲霉属(Aspergillus ) 10 甘肃平凉市华亭马峡 （2年生 西芎） 镰孢属(Fusarium ) 1 11 镰孢属(Fusarium ) 8 云南丽江泸沽湖附近（金芎）曲霉属(Aspergillus )19从表3还可以看出，川芎根茎中分离的内生真菌在数量、种群的组成上比山川芎的更丰富，这可能是川芎“高山育苓，平坝栽培”后形成优质药材的原因之一。
3. 讨论由文献报道和作者的经验知，可靠的采样方法和可靠的分离手段在植物内生真菌的研究中起着至关重要的作用，它是后续研究工作的基础。
在试验过程中，首先需制定合理的采样方法，采集没有腐烂发霉及虫害的健康川芎根茎，在最短时间内进行新鲜活体植株分离样品处理，以确保植物内生真菌的生存活力及其条件无显著变化；其次，采用5%的NaClO 浸泡根茎5min ，用自来水冲洗30min ，晾干，再在无菌条件下用75%乙醇处理，无菌水反复冲洗3~4次，达到分离材料表面的有效杀毒，从而基本上排除外界环境微生物污染的可能性；再次，在植物内生真菌分离用培养基中加入青霉素和链霉素的混合液，可以有效地抑制细菌的污染。
本文首次对不同品种和产地川芎根茎的内生真菌进行了分离、鉴定，结果表明：不同产地及不同品种川芎内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异，初步推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群结构有关。
由于纯培的方法存在一定的局限性，在随后研究中我们将进一步报道非纯培的方法分析内生微生物与川芎质量的关系，以期进一步揭示川芎道地性形成的原因。
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