细菌内毒素检查法
概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今
仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效
的方法，其优点在于：
1 科学性：有生物化学的理论基础。 2 准确性：是酶的分子生化反应，专属性 高，重现性强。 3 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵
敏度极高，
当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们 都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对 鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。 4 实用性：方法快速，操作简单，无 需特殊仪器设备，经济实用。 由于细菌内毒素检查法的优越性，已 被广泛应用于临床检验。
细菌内毒素和热 原检查法

郝树彬
基础知识 热原：注入人体后可引 起发热反应的物质。
1 材料的致热性。 2 因微生物污染造成的热原反应。
热原的检查方法


体内热原检查法——兔温法（PT) ——是一种体内的、全热原的检查方法。1942 年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使 用。 体外热原检查法（ITP) ——是一种体外的利用人血细胞反应的全热原 检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。 细菌内毒素检查法（BET) ——医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热 原。
内毒素 C因子 活化c因子
某些非热原物 质 G因子
B因子
活化b因子
活化g因子
凝固酶元 凝固蛋白原
凝固酶
凝固蛋白 凝胶
实验试剂：
鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎” 的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低 温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的
生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效
浓度表示。
鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，
试剂
75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。
操作方法
试验准备 洗液的配备 配制铬酸洗液或其他适宜 的细菌内毒素灭活剂。 玻璃器皿的洗涤 将洗涤的玻璃器皿用 洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗 液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余 的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥 后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。
热原分类——按检查法分
内毒素热原 ——革兰氏阴性细菌细胞壁的组分 非内毒素热原 ——除内毒素外的热原

热原检查法（家兔法）可用于检测 上述两种原因产生的热原反应。 细菌内毒素检查法只检测产品的细 菌内毒素含量。
试验验证未发现输液器材料的致热 性，临床发生的热原反应均为细菌内毒 素污染造成的。因此对输液器成品可采 用细菌内毒素检查法进行热原初试。
某些材料释放热原质，作用于动物体 单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促
使其产生内生性热原，作用于下丘脑
体温调节中枢，结果使动物体温升高。
热原反应给临床治疗带来极大的危害， 一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即 会出现高热症状，反应严重者会造成死亡， 故必须严格控制。
细菌内毒素的理化性质
1 耐热性：180~200摄氏度2小时干热可 完全破坏。（药典为250摄氏度至少1小时。）
实验目的：
据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集 反应的机理，以判断医疗器械或其浸 提液中细菌内毒素的限量是否符合规 定的一种方法，医疗器械/材料须经热 原实验评价证实无材料致热性，同时 经测定证实样品对细菌内毒素试验无 干扰作用后，才能采用该方法。
实验原理
细菌内毒素在钙离子，镁离子参
与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因 子激活b因子，活化的b因子激活凝固 酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成 凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。
2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器。
3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水 冲洗以除去热原。 4 不挥发性
5 被吸附性：可被树脂等吸附除去。
6 被酸碱破坏 7 被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时， 可完全破坏。
细菌内毒素生物活性

致热性 致死性 引起血液白细胞中的粒细胞下降 激活凝血系统 血压下降 诱导机体对内毒素的耐受 引起淋巴细胞的有丝分裂 诱导抗感染的非特异性 杀死肿瘤细表面可能存在的外源性内毒 素， 玻璃器皿置箱后将烤箱调至180℃，待烤
箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少 2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自
然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两
周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源
性内毒素。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中
的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生
凝集反应的灭菌注射用水。
实验用具
移液管（或刻度吸管，定量移液 器）、凝集管（ 10 × 75mm）、三角瓶、 小试管（16×100mm）、试管架、洗耳 球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱 脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃 器皿须经 180 ℃干烤至少 2 小时。塑料 用具应使用其它适宜的除细菌内毒素 方法。
热原通常是指能够致热的微生物的尸 体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。 细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性 细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。 是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物， 复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分， 具有特别强的热原活性。
热原的致热机理：细菌内毒素，
病毒，细菌及其他微生物，类固醇或
因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必
须是统一且标准的。
实验试剂


细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌 提取精制得到的内毒素，单位：EU.
用于标定细菌内毒素工作标准品和标定， 仲裁鲎试剂灵敏度。 细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素 国家标准品为基准进行标定，确定其效 价。具备均一性和稳定性。

细菌内毒素检查用水： 指与灵敏度为0.03EU/ML或更高灵敏度
浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60℃烘箱
中烘干备用 。
鲎试剂灵敏度复核
内毒素标准溶液的制备 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶 底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕， 75% 酒精 棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的 BET 水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。 置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需 浓 度 的 细 菌 内 毒 素 标 准 溶 液 即 2 . 0 λ 、1.0 λ ,0.5 λ , 0.25λ （λ 为所复核鲎试剂的标 示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上 混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。