·论著·碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD 2的研究沈继录，朱德妹，吴卫红，王明贵摘要：目的研究铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD 2与碳青霉烯类抗生素耐药的关系。
方法琼脂稀释法测定14种抗菌药物对铜绿假单胞菌的MIC 。
PCR 扩增oprD 2编码基因并进行序列分析。
十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）观察碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD 2的变化，比较敏感株和耐药株外膜蛋白的差异，统计分析采用均数t 检验。
结果141株耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南药敏试验结果显示具3种模式，以亚胺培南和美罗培南同时耐药（IMP R MEM R ）为主，占66．7%；亚胺培南耐药和美罗培南敏感（IMP R MEM S ）占32．6%；亚胺培南敏感和美罗培南耐药（IMP S MEM R ）仅占0．7%。
PCR 扩增141株耐药株oprD 2编码基因结果136株耐药株oprD 2编码基因发生显著变异，变异位点呈现多样性。
其中34株细菌的oprD 2编码基因存在大片段缺失，6株的oprD 2编码基因中有插入片段，96株有小片段缺失或不同位置的多个点突变。
另4株产金属酶菌株及1株亚胺培南敏感（美罗培南耐药）株的oprD 2编码基因未发现异常。
对其中16株碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌进行SDS-PAGE 分析，结果显示10株IPM R MEM R 和5株IPM R MEM S 铜绿假单胞菌外膜蛋白均存在分子量46000u 处的OprD 2蛋白减少，而1株IMP S MEM R 株OprD 2蛋白带未见异常。
结论oprD 2编码基因的缺失或突变可能是导致外膜蛋白OprD 2缺失或减少的分子基础，并是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素尤其是亚胺培南耐药的主要机制之一。
关键词：铜绿假单胞菌；耐药性；碳青霉烯类抗生素；外膜蛋白中图分类号：R978．11；R378．991文献标志码：A文章编号：1009-7708（2011）04-0281-06基金项目：国家973资助项目（2005CB523101）；国家自然科学基金项目（30772619）。
作者单位：复旦大学附属华山医院抗生素研究所，上海200040。
作者简介：沈继录（1974—），男，博士，主管技师，主要从事细菌耐药性及机制研究。
：：Study on outer membrane protein OprD 2of carbapenem-resistant PseudomonasaeruginosaSHEN Jilu ，ZHU Demei ，WU Weihong ，WANG Minggui．（Institute of Antibiotics ，Huashan Hospital ，Fudan Uni-versity ，Shanghai 200040，China ）Abstract ：Objective To study the relation between outer membrane protein OprD 2and carbapenem resistance in P．aerugino-sa ．Methods Minimal inhibitory concentration （MIC ）of 141strains of P．aeruginosa to imipenem and meropenem was deter-mined by agar dilution method．Outer membrane oprD 2encoding gene was analyzed by PCR and DNA sequencing．Outer mem-brane proteins were extracted from carbapenem-resistant P．aeruginosa and analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE ）．The pattern of outer membrane proteins were compared between the IMP R and IMP S strains．Results Three resist-ant patterns were identified in the 141strains of carbapenem-resistant P．aeruginosa ，including IMP R MEM R （66．7%），IMP R MEM S （32．6%）and IMP R MEM S （0．7%）．DNA sequencing showed various and significant mutations of the oprD 2encoding gene in 136of the 141imipenem resistant strains．Of these strains ，34showed large fragment missing of oprD 2encoding gene ；6with insertion ；96with small fragment missing or multiple point mutations．The oprD 2encoding gene was normal in the 4MBLs-strains and 1imipenem sensitive （meropenem resistant ）strain．The SDS-PAGE profiles of 16carbapenem-resistant P．aerugino-sa showed the loss of membrane protein OprD2at the band of 46000u ，including 10IMP R MEM R strains and 5IMP R MEM Sstrains．The OprD2profile was normal in 1IMP S MEM R strain．Conclusions The loss or mutation of oprD 2encoding gene is the molecular basis of the loss or reduction of outer membrane protein OprD2，which may contribute to the resist-ance of P．aeruginosa to imipenem．Key words ：Pseudomonas aeruginosa ；resistance ；carbap-enem ；outer membrane protein铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是医院感染的主要病原菌之一，常对多种抗菌药物耐药，给临床的感染治疗带来严重威胁，甚至导致治疗失败。
碳青霉烯类抗生素是治疗铜绿假单胞菌感染的重要抗生素。
但随着该类抗生素在临床上的广泛应用，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率呈快速上升。
文献报道该类耐药性主要是由胞壁屏障机制所致，而由碳青霉烯酶所致的耐药性只占极少部分［1］。
本研究所曾检测141株碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌的碳青霉烯酶，结果显示仅检出4株产VIM-2型金属酶菌株，检出率为3%［2］。
故本研究又对该141株碳青霉烯类抗生素耐药（亚胺培南或美罗培南耐药）铜绿假单胞菌的外膜孔蛋白OprD2进行了研究，现将结果报道如下。
材料与方法一、材料（一）实验菌株收集2005年1—12月我院临床分离的对碳青霉烯类抗生素耐药（亚胺培南或美罗培南抑菌圈≤13mm者）的铜绿假单胞菌141株。
药敏试验质控菌株ATCC27853及十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析OprD2外膜蛋白标准对照菌株PAO1均为本实验室保存菌株。
（二）抗菌药物亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南、头孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦均为OXOID公司商品。
亚胺培南为杭州默沙东制药有限公司商品（亚胺培南-西司他汀，效价按亚胺培南量计）。
美罗培南为卫生部中国生物制品药品鉴定所标准品。
（三）培养基与主要生化试剂MH琼脂培养基为OXOID公司商品。
PCR检测试剂Tag酶、Buff-er、dNTP及克隆载体PMD18Vector均为TaKaRa公司商品。
Tris碱、甘氨酸、丙烯酰胺及N，N'-亚甲双丙烯酰胺、N，N，N'N'-四甲基乙二胺（TEMED）、SDS、过硫酸胺（AP）及考马斯亮蓝R250均为上海生物工程公司商品。
PBS液及脱色液自配。
低分子量标准蛋白质（Marker）为上海西巴斯生物技术公司商品。
（四）引物根据GenBank序列（NC_002516）设计引物，并由上海英骏生物技术公司合成。
引物序列OprD-A：ATGAAAGTGATGAAGTGGAGCG，OprD-B：TTACAGGATCGACAGCGGATAG；为1332bp。
（五）生物信息学软件DNAstar软件为美国DNAstar公司产品。
Quality One凝胶成像分析软件为Bio-Rad公司产品。
二、方法（一）药敏试验纸片扩散法按CLSI2005年版［3］推荐K-B法进行。
亚胺培南、美罗培南的MIC 测定按CLSI2005年版推荐的琼脂稀释法进行。
亚胺培南和美罗培南浓度范围为128 0．06mg/L。
细菌接种菌量为1ˑ104CFU/点。
药敏试验结果判断按CLSI2006年版标准。
（二）PCR扩增oprD2编码基因序列分析Yoneyama等［4］报道亚胺培南耐药铜绿假单胞菌oprD常见的缺失突变有2种，一种为编码区395 405位11bp DNA片段小缺失；另一种为启动子上游－519位到编码区685位的1204bp DNA片段大缺失。
本研究设计oprD2全长引物对其编码基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，预期有3种结果：①当菌株染色体oprD2基因无缺失突变或者基因发生11bp的小片段缺失时或发生碱基突变时，均能扩增出相应条带，但是要明确是小片段缺失还是碱基突变还需要进一步测序分析。
②当菌株染色体oprD2基因发生1204bp的大片段缺失时，该引物不能扩增出相应的DNA片段，电泳结果呈阴性。
③当菌株染色体oprD2基因内有插入片段时，该引物也能扩增出相应的DNA片段，电泳结果呈阳性。