中国主要东方蜜蜂种群的遗传多样性分析任勤1，曹联飞2，赵红霞3,，王瑞生1，程尚1，罗文华1,曹兰1，姬聪慧*1（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.浙江省农业科学院，浙江杭州 310021；3. 广东省生物资源应用研究所，广东广州 510260）摘要：对中国具代表性的东方蜜蜂遗传资源中7个种群的线粒体DNA tRNA leu～ CO Ⅱ基因进行扩增和测序,并进行遗传多样性比较及亲缘关系分析。
结果表明，共发现43个单倍型，其中10个单倍型在GenBank数据库对比确认属于新发现单倍型；7个群体中，阿坝中蜂、滇南中蜂和海南中蜂遗传多样性水平较高，长白山中蜂遗传多样性水平较低，其他群体遗传多样性居中；不同种群间遗传距离变化较大，其中海南中蜂与滇南中蜂、阿坝中蜂间的遗传距离最大，长白山中蜂与云贵中蜂、北方中蜂、华南中蜂间的遗传距离最小；聚类分析显示7个种群可聚为4个类群。
关键词：东方蜜蜂；遗传多样性；线粒体DNA中图分类号：文献标志码：AAnalysis of genetic diversity of Apis cerana populations inChinaREN Qin1, CAO Lianfei2,ZHAO Hongxia3,WANG Ruisheng1,CHENG Shang1,LUO Wenhua1,CAO Lan1, JI Conghui*1（1.Chong Qing Academy of Animal Science，Chongqing 402460，China；2.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Zhejiang 310021，China; 3.Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangdong 510260, China）Abstract:The mitochondrial DNA tRNA leu～CO II genes in 7 populations of Apis cerana Fabricius in China were amplified and sequenced, and their genetic diversity and phylogenetic relationships were analyzed. The results showed that a total of 43 haplotypes were identified, of which 10 haplotypes were identified new haplotypes in the GenBank database, Among 7 populations, Aba bee, Hainan bee and Yunnan bee have higher level of genetic diversity, Changbai Mountain bee has lower level of genetic diversity, other populationswere intermediate; The genetic distances between different populations varied greatly, of which Hainan bee andhave maximum genetic distance with Yunnan bee and Aba bee, The genetic distances between Changbai mountain bee and Yunnan bee, Middle China bee, Northern bee and Southern bee were small.; Cluster analysis showed that the 7 populations could be clustered into 4 taxa.Key words:Apis cerana Fabricius; genetic diversity; mitochondrial DNA收稿日期：基金项目:国家蜂产业技术体系基金项目（CARS-45SYZ15）;重庆市畜牧科学院基金项目(16421).作者简介：任勤(1979-), 男, 宁夏固原人，助理研究员, 硕士研究生，主要从事蜜蜂方面的研究。
通信作者：姬聪慧(1980-)，女，河南平顶山人，助理研究员，硕士研究生。
中国东方蜜蜂资源丰富，分布于除新疆和内蒙古北部以外的广大地区[1]。
中国的东方蜜蜂资源可分为5个亚种,分别为中华亚种、西藏亚种、印度亚种、阿坝亚种和海南亚种[2-3]。
由于地理隔离等因素影响，中国东方蜜蜂在形态及遗传上存在差异，形成了不同的生态型和丰富的遗传资源，有北方中蜂、华南中蜂、华中中蜂、云贵高原中蜂、长白山中蜂、海南中蜂、滇南中蜂、阿坝中蜂和西藏中蜂[4]。
近年来，国内多位学者采用mtDNA、微卫星等分子标记对中国华东地区、江苏省、四川省、海南岛、贵州省、重庆市等地东方蜜蜂进行了遗传多样性分析，发现不同地区的中蜂存在较明显的分化[5-12]。
因此，分析更大范围的东方蜜蜂样本，对于了解其遗传分化水平具有重要意义[14]。
本研究使用线粒体DNA tRNA leu～ CO Ⅱ基因,对中国具有代表性的遗传资源北方中蜂、华南中蜂、海南中蜂等7个种群进行遗传多样性对比及群体间亲缘关系分析，为中国东方蜜蜂资源的遗传分化提供信息，从而促进中国东方蜜蜂资源的保护与利用。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品采集在中国主要东方蜜蜂分布区的12个采样地点采集东方蜜蜂样本300个（见表1），尽可能采集当地较原始饲养蜂群。
每群采集工蜂100只左右，用无水乙醇浸泡，置于冰箱中冷冻保存备用。
表1 蜜蜂样本分布情况及数量Table 1 Distribution and quantity of honeybee samples采样地点sampling position地理型topomorph样本数sample number宁夏固原Guyuan,Ningxia北方中蜂Beifang20陕西延安Yanan,Shanxi北方中蜂Beifang20山西太原Taiyuan,Shanxi北方中蜂Beifang20广东从化Conghua,Guangdong华南中蜂Huanan20广西南宁Nanning,Guangxi华南中蜂Huanan20福建福州Fuzhou,Fujian华南中蜂Huanan20云南西双版纳Xishuangbanna,Yunnan滇南中蜂Diannan301.1.2 主要仪器全称、型号及生产厂紫外可见分光光度计（KU-T6/KU-T6PC，南京肯凡电子科技有限公司）、常规PCR仪（Eppendorf Mastercycler nexus，艾本德中国有限公司）、迷你型水平电泳系统（GCMGU-102T，上海苑胜仪器设备有限公司）、台式高速冷冻离心机（TG16-WS，长沙湘锐离心机有限公司）、全自动免染凝胶成像分析系统（GelDoc EZ，济南舜腾生物技术有限公司）、基因测序仪（NextSeq 550AR，安诺优达基因科技）。
1.1.3 主要试剂细胞/组织基因组DNA提取试剂盒和蛋白酶K（北京百泰克生物技术有限公司）、dNTP、10×Buffer、TaqDNA聚合酶和Marker（大连宝生物公司）、DNA凝胶回收试剂盒（爱思进生物技术有限公司）、引物（E2 5’- GGCAG AATAAGTGCATTG-3’，H2 5’- CAATATCATTGATGACC-3’）（上海生工生物工程有限公司合成）。
1.2 方法1.2.1 基因组DNA的提取每个蜜蜂样本取1只工蜂进行试验。
取出被无水乙醇浸泡过的蜜蜂个体，在灭菌水中清洗3次，取蜜蜂胸部置于1.5 mL的离心管中, 用小剪刀剪碎, 按照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书提取基因组DNA。
基因组DNA用TE溶解后于-20℃保存，备用。
1.2.2 PCR扩增与测序1.2.2.1反应体系(50 μL) 模板DNA 2 μL，10×Buffer (含Mg2+) 5 μL，2.5 mmol·L-1的dNTPs 4 μL，10 pmol· L-1的引物各2 μL，5 U Taq酶0.5 μL，灭菌双蒸水34.5 μL。
1.2.2.2反应条件 95 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min, 50 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环；72 ℃再延伸10 min。
PCR 产物纯化后使用测序仪（型号为ABI PRISM 3730 ×l）进行测序。
1.2.3 序列分析利用SeqMan程序对测定获得的序列进行校对，用MegAlign软件比对所有序列。
通过DnaSP 5.0 软件输出单倍型序列，同时计算各样点的单倍型多样度（Hd）、平均核苷酸差异数（K）、核苷酸多样度（Pi）。
用MEGA3.1 软件构建系统进化树。
2 结果与分析2.1PCR扩增及测序结果所有样本均成功进行了扩增和测序，扩增的片段大小约为450 bp, 与目的片段大小一致，测序获得序列长度约为400 bp，扩增结果如图1。
1为空白对照，2-21为部分样品的扩增结果，M为250bp Plus DNA Marker1: blank control; 2-21: Amplification result of some samples; M: 250bp Plus DNA Marker图1 PCR产物电泳结果Fig. 1 Electrophoresis results of PCR products2.2 序列特征分析所有序列比对后, 获得一致序列为415 bp, 包括tRNA leu基因部分序列(1～18 bp)、非编码区完全序列(19～108 bp) 和COⅡ部分序列( 109～415 bp)。
所有序列中A+ T含量均在80%以上，所有序列分析表明，多态性位点有31个，其中单变异位点22个，简约信息位点9个，测序结果如图2。
图2 测序结果Fig. 2 sequencing result2.3 单倍型分析共检测到单倍型43个。
H2单倍型是主要单倍型，占总样本数的46.52%。
其余单倍型比例均小于10%，其中有16个单倍型的比例大于1%。
43个单倍型中，10个单倍型在GenBank 数据库中比对确认属于新发现的单倍型，提交的序列号为MG197799-197808。