单克隆抗体制备方案单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1 动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。

为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。

1.2免疫原制备15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。

取1ml加入7mlPBS 中，混匀。

从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。

反复摇晃，用注射器反复推吸。

取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。

4℃保存。

100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。

取1ml加入3mlPBS 中，混匀。

从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。

反复摇晃，用注射器反复推吸。

取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。

4℃保存。

150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。

取1ml加入2mlPBS 中，混匀。

从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。

反复摇晃，用注射器反复推吸。

取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。

4℃保存。

200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。

取1ml加入1mlPBS 中，混匀。

从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。

反复摇晃，用注射器反复推吸。

取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。

4℃保存。

250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。

取1ml加入1mlPBS 中，混匀。

从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。

反复摇晃，用注射器反复推吸。

取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。

4℃保存。

1.3 实验步骤初次免疫： 50μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中，加等体积的福氏完全佐剂（CFA）腹腔和皮下注射。

（共25只小鼠，每组5只，两只采用背部皮下注射，共1ml，0.2ml/点，3只采用腹腔注射）3周后第二次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂（IFA），腹腔和皮下注射3周后第三次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA，腹腔和皮下注射，5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价2～3周后加强免疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，静脉或脾内缓慢注射，以免动物发生过敏性休克而死亡。

3～4天后腹腔注射大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤，腹部向上，将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠尾；右手持连有5号针头的注射器，将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔，回抽无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进行注射。

进行腹腔注射时应注意：1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破内脏。

2、针头与腹腔的角度不宜太小，否则容易刺入皮下。

3、用的针头不要太粗，以免药液注射后从注射孔流出。

注射后用棉球按一下注射部位。

4、为避免注射后药液从针孔流出，也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。

皮下注射皮下注射较简单，一般都取背部及后腿皮下。

注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即进行注射。

注射器针头不易进入，硬进容易折断针头，故给这些动物作皮下注射时不应选背部皮肤。

一般狗、猫多在大腿外侧；豚鼠在后大腿内侧或小腹部；大鼠可在侧下腹部。

兔在背部或耳根部注射。

1.4 注意事项①免疫时抗原的剂量应根据其免疫原性制定，若免疫原性较弱，需在50～100μg 基础上增加。

②商品化的福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

抗原溶液的体积不能大于佐剂的体积，否则很难乳化好。

一般首次注射时佐剂和抗原溶液的比例为1:1。

③佐剂加入抗原后一定要充分混合成乳剂，混合的方法有研磨法和注射器混合法。

乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中，如立即散开，则未乳化好；如保持完整不散开，呈滴状漂在水面则为乳化完全。

乳化过的物质放置一段时间出现油水分层也表明未乳化好。

④测抗体效价的方法有ELISA间接法、免疫双扩散法、环状实验等。

用双向免疫法测定时效价达到1：16以上可用于融合实验；用ELISA方法测定时效价达到1：16000后可用于融合。

皮下注射给药皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。

作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。

操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。

拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。

二、脾淋巴细胞1. 试剂4%的台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨后，再加蒸馏水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。

使用时需用0.1mol/L的PBS稀释至0.4％（w/v），即1ml 4%的台盼蓝加9ml 0.1mol/L的PBS。

RPMI-1640培养液10%FCS-1640培养液2. 试验步骤①加强免疫3天后摘除眼球放血，收集血清留作抗体检测时的阳性对照。

试管静置30～60min后，将血块轻轻剥离管壁，3000r/min离心15～20min，吸取上清（血清）4℃冰箱保存备用。

②脱椎处死小鼠，浸泡于75％酒精中消毒1min③在超净工作台中用无菌手术剪刀剪开小鼠左侧皮肤，暴露腹膜，打开腹腔，在无菌条件下取出脾脏置于盛有10ml不完全RPMI-1640培养液的平皿中，轻轻洗去脾脏上的红细胞并细心剥去周围结缔组织，于盛有10ml的RPMI-1640培养液的无菌平皿中过不锈钢筛网用注射器针芯研磨脾脏后用玻璃吸管吹打数次制成细胞悬液，移入10ml离心管中。

④沉降大块的结缔组织，把细胞悬液转移到50ml离心管中⑤以RMPI-1640培养液充满50ml离心管，配平后在室温下以1000r/min离心10min，弃上清⑥用约10ml的新鲜RPMI-1640培养液重悬⑦重复⑤⑥步骤⑧计数活细胞：把细胞悬液稀释到约6个/ml，将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。

用移液枪取0.9ml细胞悬液和0.1ml浓度0.4％的台盼蓝工作液于EP管中，充分混匀中静置1～2min，不超过5min。

如果染色时间太久，细胞将下沉或受损，而且部分活细胞也会着色。

用加样器小心混匀细胞悬液后，立即用微量加样器将其加于血球计数板，置于倒置显微镜下观察并计数活细胞和死细胞。

死细胞被染成淡蓝色，活细胞排斥台盼兰，不被染色。

活细胞数大于80%为合格。

3. 注意事项①取样计数前应充分混匀细胞悬液。

②数细胞的原则是只计数完整的细胞，镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

若细胞压在格线上时，只计上侧和左方的。

③操作时注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

④一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×108左右。

三、饲养细胞①10～12周龄Balb/c小鼠脱椎处死，浸泡于75％酒精，消毒3min～5min②用注射器抽取5ml预冷的10%的FCS-1640培养液注射到小鼠腹腔（严禁刺破肠管）并用手指轻揉3min～5min后，用无菌剪刀剪开小鼠腹部一小口，用圆头尖吸管吸出并移入50ml离心管中。

吸的过程一定不要刺破肠管以免细菌污染。

③室温1200r/min离心5min～6min④弃上清液，用10%胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105个/ml⑤将细胞转入96孔培养板，每孔100μl，放入37℃CO2培养箱中培养.四、骨髓瘤细胞1.骨髓瘤细胞介绍目前应用最多的是Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株SP2/0-Ag14（简称SP2/0）细胞株。

骨髓瘤细胞适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。

细胞的最大密度不得超106个/ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。

细胞的倍增时间为16～20小时。

一般在融合前两周就应该对其进行复苏。

SP2/0细胞为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

在细胞融合的前一天用新鲜的10%FCS-1640培养基调整细胞浓度为2.0×105个/ml，次日取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，于室温1000g（3000r/min）离心10min收集沉淀，以无血清RPMI-1640培养液重悬并计数。

此时细胞形态良好，观察形态完整，排列整齐，密度为0.1×106～1×106个/ml。

经胎盼蓝染色活细胞数>95%。

SP2/0细胞是肿瘤细胞株，一般注射到小鼠体内约1周左右就可以使小鼠致死。

在其状态萎靡的时候就可以用基础培养基洗出其腹腔中的细胞，分离SP2/0细胞。

整个过程要保证无菌，否则就前功尽弃了。

为了防止骨髓瘤细胞（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT缺陷株）变异出现返祖现象，在融合前骨髓瘤细胞株可在含有15μg/ml或20μg/ml的8－氮鸟嘌呤(8-AG)的培养基内适应性培养一周或定期对细胞进行筛选，再转入完全培养基培养1～2周即可用于融合。

8-AG一般试剂公司都有（如Sigma），使用时需仔细看说明，根据根据说明配置相应浓度的8-AG。

2.细胞培养①每月用新洁尔灭或84消毒液擦拭无菌间的所有所有器件、地板和墙壁一次，进行彻底消毒。

②一般在实验前用紫外灯照射无菌室30～60min，实验做完后再用紫外灯照射30min。

配合紫外线灭菌灯使实验室经常保持高度的无菌状态。

紫外灯开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子，这种气体分子具有很强的杀菌作用，可以对紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。

由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应先关掉紫外线灯，关后十分钟即可进入。

③实验前开启超净工作台内紫外灯，照射10～30min，然后让超净工作台预工作10min～15min，以除去臭氧和使工作台面空间呈净化状态。

④进入无菌培养室原则上应按外科手术进行洗手和着装，即穿戴无菌服、帽子和口罩，并换鞋。

用后要清洗消毒备用。

开始操作前用75%酒精和0.2%新洁尔灭消毒手和前臂，洗手时要洗刷到肘部。

使用过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。

⑤无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。