①相同种属来源
②相同免疫球蛋白及亚型
③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 •用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产 生的背景染色
C、阳性对照 Positive Control • 设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都 必须设置： 使用新的荧光素抗体时； 使用存储时间较长的荧光素抗体时。
激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
22.5 hours
3）流式试验对照设置 • A、空白对照 Negative Control 细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染 色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。 设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特 异性荧光，避免假阳性的结果。
001
001
SP 500
BP500/50
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。 • FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
•线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白 含量 •对数测量：细胞膜表面抗原检测
直方图（Distribution Histogram） 散点图（Dot Plot） •横坐标：某细胞参数 •横坐标：道数 相对含量 •纵坐标：细胞数 •纵坐标：该细胞另一 参数含量
等高线图（Contour Plot）
细胞分选系统
• 细胞周期分析核酸染料 细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不 能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细 胞膜的通透性。 细胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等能染活细胞的 DNA，但需紫外激光激发。 • PI标记法检测细胞周期 需要乙醇固定增加细胞膜的通透性； 需要加RNase，去除RNA对DNA的干扰。
002
• 流式结果中荧光强弱是一个相对值，光 电倍增管电压越大，电子信号越强；电 压越小，信号越弱。 • 通过调节电压，使阴性对照管的荧光强 度处于阴性的位置，实验组的荧光值都 是相对对照组。
B、同型对照 Isotype Control •同型对照抗体：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的 免疫球蛋白亚型 （Fc段相同，F（ab’）2段不同） •与染色的单克隆抗体：
•分析细胞活性，细胞凋亡，和细胞
周期； •研究细胞的分化过程； •研究细胞增殖； •。。。
离成单细胞后）；
•肿瘤细胞系表型分析； •细胞活性的检测； •。。。
在高通量检测和新药研发中的应用： •细胞功能变化的研究； •细胞周期和活性； •细胞凋亡； •细胞增殖； •新药研发； •培养基研发； •。。。
B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素
• 荧光素的强度： 染色指数 Stain Index
Stain Index = D/W CD4
• 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表 达低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE
FSC
CD4 FITC
Foxp3 PE
海洋生物学 •富集和分析细菌，藻类，浮游植物 等 微生物学 •细菌和酵母检测； •荧光蛋白检测。 生物燃料 •Bodipy® 和/或 Nile Red中脂类的 定量 •藻类，蓝藻细菌，酵母和细菌等生 物的富集
四、常见流式细胞术应用
4.1 细胞周期检测 • 处于不同细胞周期的细胞DNA含量不 同，G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA ，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA， 而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍 体量之间。 • DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含 量的多少与荧光染料的结合量成正比 ，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子 的多少。通过流式检测就能反映细胞 内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1 期、S期和G2/M期细胞比例。
常用荧光素
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 • 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 • DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。 • Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。 • PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 • AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
在肿瘤研究中的应用： •细胞凋亡的检测； •细胞周期分析； •细胞增殖研究； •荧光蛋白分析； •肿瘤干细胞的鉴定和功能分析； •循环肿瘤细胞的鉴定和功能分析； •实体瘤细胞的检测分析（肿瘤组织解
在细胞生物学和分子生物学研究中 的应用： •检测细胞转染效率； •检测转导效率； •分析细胞中荧光蛋白的表达； •分析蛋白—蛋白之间的相互作用 （FRET）
FL2-no stain
FL1-FITC stain
FL1-FITC stain
FL1-FITC stain
准确补偿的重要性
补偿调节要合适
未补偿 正确补偿
FITC-PE补偿太大
PE-FITC补偿太大
举例：双染实验
• 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同 型对照抗体分别染色 • n色分析就要制备n 个补偿对照管
• 细胞因子分泌细胞研究
• 全血细胞研究 • 凋亡检测
• 不同类型的神经细胞的鉴定和功
能研究； • 星形胶质细胞和胶质细胞的鉴定
• 细胞增殖检测
• 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
和功能研究；
• 检测细胞活性，细胞凋亡和细胞 周期； • 神经细胞ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ育过程研究 • 干细胞向神经细胞分化研究 • 。。。
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
＜
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光 • 荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等) 抗体偶联荧光素； 分子探针结合荧光素Annexin V-FITC； • 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合； – 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
什么样的补偿最合适？
• 单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时 为最合适的补偿。
Uncompensated
PE-Medianneg < PE-Medianpos
Compensated
PE-Medianneg= PE-Medianpos
Overcompensated
PE-Medianneg > PE-Medianpos
表面受体 黏附因子 胞内抗原
医学应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性 研究；
SSC
SSC
CD25 APC
C、选择光谱重叠小的染料
• 尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7； • 选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC；
D、尽量避免偶联染料使用带来的假阳性
CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5 样本曝光时间
0 hour
PE 2 hours
• 设置阳性对照的方法： 用肯定表达有该抗原的细胞来检测； 已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。
D、 单标对照 Single Staining Control
•什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠 •为什么要进行补偿调节？
FITC PE
laser
PC5
400
500 520 575
600
流式细胞术原理及应用
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造 二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直线 流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量分 析和分选技术. • 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。 • 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量 分析。