第二章 生物样品的预处理
生物样品中往往含有大量有机物、无 机物及各种微量元素等，因此对目标组分 进行初步富集和分离，对干扰组分进行初 步去除等工作都属于预处理。
第二章预处理
种类：
植物或动物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、 乳液和动植物组织提取液等。
特征：
⑴ 目标产物浓度较低，悬浮液大部分是“水”，组 分复杂，是含多种物质的混合物；
珠磨法 压榨 高压匀浆 超声破碎
酶溶法 化学法 物理法
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二、常用的几种破碎方法 ㈠． 组织捣碎
原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞
利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将 组织细胞破碎。（10000～20000r/min）
⑵ 分离过程易失活，pH、离子度、温度等变化常常 造成产物的失活；
⑶ 性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生 物污染，蛋白水解作用等。
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1.植物组织
植物组织被破坏时，一些目的物和酚 类处混合接触状态，很易发生反应。产物 苯醌和单宁酸类会继续和目的物反应, 使 目的物失去活性。为此去除酚类化合物或 避免反应往往是必须进行的步骤。
1）盐析 2）等电点沉淀 3）加热法 4）有机溶剂沉淀法 5）吸附法 6）其它沉淀法
第二章预处理
•有色物质的去除 常用脱色方法为吸附法
如活性炭吸附、树脂吸附等
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发酵液处理性能的改善
降低发酵液的黏度 加热法和加水稀释法
调节pH值 因pH直接影响发酵液中某些物质的
电离度和电荷性质，通过调节pH值可以 改善过滤特性。
聚苯乙烯和聚丙烯树脂：如基于聚苯乙烯
的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂和 阳离子交换树脂。
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氧化酶抑制剂的种类
2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓 糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，而抗坏血酸盐则 较少使用。
前三种既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清 除剂；
抗坏血酸盐在低浓度的醌存在下就很易被消 耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用 （50mmol/L）。
一、概述
细胞的破碎：
用一定方法（机械法、物理法、化学 法、酶法等）打开细胞壁或膜，使细胞的 内含物有效地释放出来。
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提取： 目的物从胞内转移到外界溶液中
（提取剂）
细胞 （提取剂）
破碎
匀浆
离心
提取液（液体目的物）
沉淀 洗涤 提取物（固体目的物）
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机械法
破碎方法
非机械法
固体剪切力 液体剪切力 干燥处理 溶液作用
对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物 转移到液相，然后经固液分离除去固相；
对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经 细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎 片分离。
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3.1 微生物发酵液预处理 主要包括 1）发酵液杂质的去除 2）改善培养液的处理性能
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发酵液杂质的去除
（3）双电层理论
细胞表面本身有电荷，加入的电解质的排斥作用而 促使细胞产生聚并作用。
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3.2 大肠杆菌重组蛋白的提取制备
多拷贝质粒上强启动子过量表达重组蛋白 质使整个细胞的蛋白质表达水平提高,但大多情 形下会导致诸如包含体的不溶性蛋白聚集的形 成.
重组菌E. coli M15(pQE32-AG第N)二外章源预基处因理的诱导表达(A未诱导，B诱导)
发酵成分复杂，对提取影响最大的是高价无 机离子和杂蛋白 主要影响后期离子交换、萃取、膜过滤等……
无机离子的去除
钙离子: 加入草酸(形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还
能促使蛋白质凝固
镁离子: 加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物，可
不再干扰离子交换
铁离子: 加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀
第二章预处理
•可溶性蛋白质的去除：
第二章预处理
植物组织预处理需注意：
⑴ 温度尽可能低；
⑵ 提取液的量要保证“充分浸入”； ⑶ 加入足量酚类吸附剂； ⑷ 加入足量氧化酶抑制剂； ⑸ 搅拌转速要恰当； ⑹ pH要控制在合适范围，一般5.5～7.0 。
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酚类吸附剂的种类：
天然和合成的聚合物：如清蛋白、尼龙粉、 聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）和聚乙烯 聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP）
微生物絮凝剂具较好发展潜力，主要以多 糖、多聚氨基酸蛋白质或糖蛋白为主，还 有少量的DNA和脂类絮凝剂；
絮凝效果与加入量、分子量和类型，溶液 的pH值、搅拌速率和时间等因素有关。
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絮凝机理
（1）胶体理论
细菌可看做胶粒，因细胞表面的极性基团引起的表 面吸附…….
（2）高聚物架桥理论
细胞表面分泌的高聚物形成的胞外纤丝通过架桥交 联而使细胞絮凝。
重组蛋白的提取步骤
1．大肠杆菌的酶解 采用溶菌酶或超声破碎方法来破壁
2．包含体的清洗 用溶剂清洗包含体能进一步除去杂蛋白
3．从包含体中溶解重组蛋白（变性） 选择和优化溶解液（一般为尿素和盐酸胍）， 使包含体中重组蛋白溶解
4. 重组蛋白的复性 稀释法、透析法、层析法、分子伴侣等
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第二节 细胞的破碎与提取
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絮凝剂分类
习惯分为： 无机絮凝剂、有机絮凝剂
无机絮凝剂： 无机盐类絮凝剂(如硫酸铝、 硫酸亚铁、氯
化铝等)；无机高分子絮凝剂(如聚合氯化铝、 聚合铝铁等) 有机絮凝剂：
天然高分子 絮凝剂(如淀粉的改性产物)； 人工合成高分子絮凝剂 (如阳离子聚丙烯酰胺)
第二章预处理
无机与有机复合絮凝剂往往效果更好；
第二章预处理
细菌及某些放线菌菌体细小，发酵 液粘度大，往往不能直接过滤，直接用 离心法实现，则能耗很大，应用微滤的 方法，又容易产生膜堵塞。此时可选择 采用细胞絮凝技术。
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细胞絮凝技术
指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥 作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一 种以物理的集合为主的过程。 通常需控制絮凝剂浓度保持在较窄的范围内, 如胶体的颗粒表面吸附大量的高分 子物质,反而 会在表面形成空间保护层。
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2. 动物组织预处理
匀浆化前的预处理 (冷冻) 提取物缓冲液的选择(中性) 蛋白酶抑制剂的添加 保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等 ) 提取液的澄清 ( 高速离心、沉淀、吸附等)
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3. 微生物物质的提取制备
大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产 物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。