细胞生物学实验
吉林师范大学
实验课要求
1.安全第一。 2.认真听课，随时发问。 3.上课期间不要吃东西，手机调到震动。 4.缺课1/3以上者直接进入重修。 5.成绩包括：实验报告，平时成绩，期末小考。
实验一 细胞形态及细胞器的观察
实验目的 （1）学习普通光学显微镜的构造和原理，重点掌 握光学显微镜的规范操作方法。 （2）观察动植物细胞的细胞及其细胞器结构，重 点观察有丝分时期的形态结构特征及染色体的变 化规律。
前期 Prophase （1）染色质(chromatin)凝缩成染色体(由两条 染色单体组成)； （2）中心体(centrosome)移向两极，分裂极确 立，纺锤体(spindle)开始装配； （3）核仁(nucleonus)消失，核被膜裂解； 前中期 Prometaphase （1）染色体进一步凝集浓缩，变粗变短； （2）纺锤体形成，纺锤丝捕获染色体，并拉动染 色体向纺锤体赤道面移动。
观察细胞及细胞器的形态
口腔上皮细胞
洋葱表皮鳞状细胞
植物和动物细胞形态差别
动植物细胞都可以观察到细胞核 动物细胞没有细胞壁（形状不规则） 植物细胞具有细胞壁（形状较为规则）
洋葱根尖细胞
细胞有丝分裂
根据细胞形态结构的变化，将有丝分裂人为地划 分为6个时期： 前期(prophase)、前中期(premetaphase)、中期 (metaphase)、后期(anaphase)和末期 (telophase)、胞质分裂。
3.9工作距离
工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面 到被检物体之间的距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔 径角则大。 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。
提高显微镜分辨率的方法：
（1）增大物镜的数值孔径 在物镜和盖玻片之间充以n 较大的油，如香柏油n =1.52,不仅使n 增大，而且孔径角 也增大。 （2）用短波长的光照射 如紫外光显微镜，电子显微镜。
1611年，德国天文学家开普勒用两片双凸透镜 分别作为物镜和目镜，使放大倍数有了明显的提高， 以后人们将这种光学系统称为开普勒式望远镜。人 们用的折射式望远镜还是这两种形式，天文望远镜 一般是采用开普勒式。
罗伯特· 虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：140倍
2 显微镜的光学原理
折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以 直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则 发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度 不同造成的。
像差
球差
场曲
象散
负畸变
慧差
正畸变
色差
色差校正
3.7焦点深度
在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看 得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清。这段 距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这 段距离的上下限叫焦点深度。
焦点深度
3.8视场数
目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。 显微镜的总放大率小的时候所能看到的标 本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本 的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率 成反比。 在同一总放大率的条件下视野也可有大小 差别。这种差别决定于目镜的某些性能。首先 目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。视场 光栏的直径叫目镜的视场数值．
4 显微镜的结构
光学放大系统
目镜 物镜 光源 折光镜
组成
照明系统
聚光镜
滤光片
机械和支架系统
光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 载物台和切片夹 (Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course and fine focus knob) 7. 目镜(Oculars) 8. 照相机等接口 (Connection to camera, etc.)
聚光镜光栏 所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光 束截面的框孔都可认为光栏。 聚光镜光栏作用 （1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值 孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。 （2）辅助调整亮度。
5 光学显微镜的使用
实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置， 镜座应距桌沿 6～7 cm左右。 打开光源开关，调节光强到合适大小。 转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光 孔。 将所要观察的玻片放在载物台上，使玻片中被观察 的部分位于通光孔的正中央。 先用低倍镜观察（4X）。观察之前，先转动粗动调 焦手轮，使载物台上升，物镜逐渐接近玻片。需要 注意，不能使物镜触及玻片，然后，通过目镜观察 ，并转动粗调焦手轮，使载物台慢慢下降，直到看 清物像。
瞳距调节
屈光度调节
光学显微镜的维护
显微镜要轻拿轻放。 严禁将表面有水的载片放到显微镜上。 从低倍转入高倍应能看到图象，否则需转入低倍 另行调节、查找原因。 每次使用完毕后将将光源亮度调至最低。 临时不用显微镜只需将光源亮度调至最低而无需 关闭。忌频繁开关显微镜电源。 镜头脏污只能用专用工具经专门程序清洗。 使用完毕等灯箱冷却后罩上防尘罩或放入箱内， 并存于干燥无尘处。
物镜结构
物镜壳上的标志：
(1)物镜的种类 APO(复消色差物镜) FL(萤石物镜或半复消色差物镜)
PL(平场物镜)
PL．FL(平场萤石物镜）
PL．APO(平场复消色差物镜)
2)放大倍数 用数字表示，如4、10、20、40和100等。 (3)数值孔径（N．A） 如10／0.25，40／0.65和100／1.3 (4)标准机械筒长 160mm、170mm或∞ (5)需用盖片情况 160／0.17 160／0或160／-；∞／0或∞／-
实验用品
普通光学显微镜以及动植物细胞装片。 口腔上皮细胞，洋葱鳞茎表皮细胞，洋葱 根尖细胞。
主要内容
显微镜的发展 显微镜的光学原理 显微镜的几个基本概念 显微镜的结构 显微镜的使用 观察细胞及细胞器的形态-实际操作
几个重要的分辨率
人眼：0.2mm 光学显微镜：0.2um 电子显微镜：0.2nm
显微镜的成像原理
显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把 近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察 。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率 而已。 物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于 物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它 经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像 A'B'。 A'B'靠近F2的位置上。再经目镜放大 为虚像A''B''后供眼睛观察。目镜的作用与放 大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到 的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经 放大了一次的像。
3 显微镜的几个基本概念
3.1 光源：能发射光波的物体。 可见光频率范围：7.5×1014 - 3.9×1014 Hz。 真空中对应的波长范围：390nm – 760nm 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红
3.2分辨率(鉴别距离)：显微镜能分辨的最小距离，用 D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高。 D=0.61λ / nsin D：分辨率 λ :光波的波长 N:介质折射率 α :物 镜镜口角 3.3孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线 L和进入物镜中心光线OA之间的夹角称为孔径角。 3.4数值孔径：N·A = nsin , 叫物镜的数值孔径 。 数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短 ，NA越大，分辨率越高。
中期 metaphase （1）所有染色体排列到赤道板(equatorial plate)； （2）纺锤体呈典型的纺锤样，位于染色体两侧的 动粒微管长度相等，作用力均衡。 后期 anaphase 中期染色体的两条染色单体相互分离，形成子代 ，并分别向两极运动。 (1)后期A anaphase A:动粒微管缩短，拉动染 色单体移向两极； (2)后期B anaphase B:极性微管延长，两极间 距离逐渐增长；
1.显微镜的发展
1.1 人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的 情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相 距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物 体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成 是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领 。
1.2 放大镜：约在四百年前眼镜片工匠们开始磨制 放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有3—5x 1.3 显微镜： 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显 微镜的放大仪器。 1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜 式的高倍显微镜 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的 古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术 ，
4.1物镜
物镜(objective)是光学显微镜成像系统中 决定其分辨率或) 色差校正使可见光中红光和蓝光聚焦于一 点，而黄绿光则聚焦于另一点。能够消除光谱 中红光和蓝光所形成的色差。这种物镜与目镜 配用时可达到消色差物镜所要求的光学性能。 (2)复消色差物镜(apochromat) 是性能最高的物镜。能消除可视光中黄、红 、蓝即包括几乎所有谱线在成像过程中所造成 的色差。
物镜数值孔径
3.6放大率
在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大 小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。显微镜 下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所 决定。适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径 ，一船应为数值孔径的500――1000倍。

显微镜的总放大率（Mt)应为： Mt=Mob×Me Mob：物镜放大率 Me：目镜放大率
2.2凸透镜的五种成象规律
(1) 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象 方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； (2) 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方 二倍焦距上形成同样大小的倒立实象； (3) 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外 时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象； (4) 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成 象； (5) 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无 象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形 成放大的直立虚象。