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Introduction
ž LSCM 是一种高科技显微镜
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荧计光像无细光算探。损胞显机针伤三,微进的维镜 行得“ 立成图到光体生像像细学机物w为处胞构切秀w基理或片w-础组,”.专b织，使b心i内加用o做o部装紫.生c微了 外o物m细激 或结光 可构扫 见的描 光荧装 激光置 发,图荧
在生命科学领域的分子水平,细胞
及组织水平的研究中得到广泛应 用.
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ž 在细胞原位用特异探针标
ž 记激并 镜子出素用成的核,激像定磷酸光,位脂从,扫,蛋,而定多描白实性糖共质现及生,受聚,上定物多体w焦述量肽秀等w显大 检,w酶分-微分 测.专,子bb心io做o.生co物m
集(左图) ,这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长滤片和吸收波长滤片来完成对不同的
荧光标记进行选择性的成像。
ž 最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术（右图）,配上合适的激光源后,能够摆脱 传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择最佳波长) ,这一特点对于现在和未来开发出的各种新的荧 光标记物(特别是各种荧光蛋白和荧光染料) 和研究动植物的自发荧光物质有很高的价值,从某种意义上,
②用荧光标记细胞内的离子,可以单标记一种离子也可以多标记几种离子,检测细胞内如pH 和钠、 钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。
③用荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,通过对膜上、胞浆内多种免疫物质 的标记， 可以实现在同一张样品上同时进行多重物质标记,同时观察这些物质;
④对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠、重复性优良; 数据图像可及时输出或长期储存。
1线粒体 Mitochondria Rodamin 123 Mitotracker Green FM
物 Mitotracker Orange CMTMRos 生 Mitotracker Orange -专心io做 2 溶酶体 Lysosome 秀 b 中性红 物 .b AO 生 www LysoTracker Green DND-26 / Blue/ Red
ž 实时动态分析监测
激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机 等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
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LSCM的基本组成
ž 光学显微镜部
生物w秀ww-.专bb心io做o.生cožžžž物m分 激 扫 光 计 ( 光 描 检 算 包发 装 测 机 括射 系置 器 数器 统据采
ž 激发光和发射光都通过滤片来调节波长，滤片是成对的，调节起来很方便。（左）
ž 科学研究工作对更高图像分辨率的追求产生了激光扫描共聚焦显微镜。随着免疫荧光技术在生物学研究 领域的广泛应用,研究人员注意到,荧光显微照片的分辨率较低, 传统的荧光显微镜使用场光源,因标本 邻近结构(细胞或亚细胞结构) 产生的衍射光和散射光的干扰,使标本中细微结构的成像不够清晰。
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ž 激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技 术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。它是在荧光
生物 ž 显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处 心做 com 理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微
细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑
illuminating pinhole:照明针孔
物 功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光 生 源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性
以及平面偏振激发等独特的优点。且与detector
心做 com pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。 -专 ioo. 分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后,
间直ž 标骨标架:: 二一(微抗抗丝++荧荧,微生光光管物w探探和秀w针针中w-((.专如如等bb::心纤微肌io维做o管动.)生c蛋蛋o物m白白atucbtilnin))
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ž 检测核酸的荧光探针
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1膜23 碘HAOo化e(吖c丙h啶s啶t3橙3(P)3I4)-2生-,-H不物ow能e秀wc进hw-s入t.3专完b32b心整5io8做的o和.细生cDo胞A物mPI
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ž (一)在细胞原位检测核酸
ž (二) 原位检测蛋白质,抗体及其他分子
ž (三)检测细胞凋亡
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(((((八四五六七)))))检细检观检测胞测察测细器细细细观胞胞胞胞生察融骨间内物w及合架缝脂秀w测隙肪w-定连.专b接b心i通o做o讯.生co物m
集, 处理, 转 换, 应用软件)
ž 图像输出设备
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LSCM的原理
激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微 镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图 像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。而LSCM 以 激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相 干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的 气体激光器如氩(Ar) ﹑氪(Kr) ﹑氦(He)﹑氖(Ne)。
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通21法3 脱细A常(Tn氧胞U用neN核核的xEi苷形n方L-)生V态酸法试物观未:w剂秀察端w盒w-转是.专移b检b心酶io测做介o.凋生导co亡物m的细缺胞口膜末损端伤标的记
3 内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6
4 高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie
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ž 根据不同细胞的特性,将每一种细胞特有的物质用不同
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LSCM的发展

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滤片式LSCM
棱镜狭缝分光式LSCM
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干扰较小
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3 绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）
n*可Aeq对uo活ren细+ 胞肠C腔中a生2素+的物蛋w秀白ww质-蓝.专进色bb荧心行i光o准做o.确生co定物mG位FP及动态绿观色荧察光
这一技术革新已使新一代激光扫描共聚焦显微镜超脱了传统的荧光显微镜系统。与此同时用于激光扫描
共聚焦显微镜的物镜也做了较大的改进, 可以与高速扫描功能相匹配。
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LSCM常用于生物细胞或组织内
以的亚监及分细测活子胞. 体原结细位构胞鉴形或定态组和学生织定观功物量察w能秀,;w细的w-胞动.专及态bb心io做o.生co物m
计算机，迅速在屏幕上形成荧光图像。
关键在于：照明针孔与detector pinhole(探测器针孔)及焦 平面形成共聚焦装置。
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生物w秀ww-.专bb心io做o.生co物m
通过调节分光镜（一般是调节反光镜），调节光路，使激发光的焦点恰好通过探 测器针孔，随后进入光电倍增管。不在针孔处聚焦的光不能通过。
通过物镜在样品聚焦。对标本内焦平面上的每一点进行扫
秀 bb描, 物 . Focal plane:焦平面 生 ww 功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标 w 记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过物镜和分
光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两
处聚焦。共聚焦的含义由此而来。标本上的被照射点所发 射的荧光沿同一光路进入物镜, 穿过分光镜后在探测针孔 处成像, 该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。然后 经探测针孔后的光电倍增管(PMT) 或冷电感耦合器件 (cCCD) 逐点或逐线接收,将光信号转变为电信号，传输至
ž ž
融的一如合荧细在光操胞同作控一; 后针细,标胞确记中认生;同不物w时同秀w检的w-测荧.专b光到b心i信上o做o号述.生c是不o物m否同发的生荧共光定信位号于,则同说
明已经发生了细胞融合.
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LSCM对生物样品的观察的优越性：
ž 连续扫描 三维
离子荧光标记 物 ž 同时多重物质标记 心做生com ž 物秀-.专bbioo. 在对生物样品的观察中,激光共聚焦显微镜有如下优越性: 生 ww ①对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描,可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系 w 统的三维图像。
ž ž
物 早期的激光扫描共聚焦显微镜采用的是扫描速度较快的狭缝扫描方式,由于其在平行狭缝的光轴面上无 生 共聚焦原理,图像分辨率不高,而被淘汰。随后发展起来的是阶梯式扫描技术,它克服轴外像差,平行移动 做 工作台来逐点扫描标本,提高了图像分辨率,但是对标本制备要求太高,也难于成为成熟的技术。现在的 心 com 激光扫描共聚焦显微镜采用的是驱动式光束扫描器,具有扫描速度较快和符合共聚焦原理的特点。 秀-专bioo. 目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进。首先是激光器的快速发展,使 b 得现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器。选择激光光源时,一方面要满足 物 w. 研究工作对波长的需求,另一个方面要考虑到激光光源的寿命。其次是近年来对于激光束分光和荧光采 生 ww 集原理也有较大的突破,目前大部分激光扫描共聚焦显微镜仍采用选择性波长滤片轮进行分光和荧光采