利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡
1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理
细胞。

(设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组，2μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L 辛伐他汀组
正常对照组 (NC 组)：胰岛素终浓度 0.058mg/L
A 组：辛伐他汀终浓度2μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ；
B 组：辛伐他汀终浓度5μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ；
C 组：辛伐他汀终浓度10μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ；
于 37℃， 5%CO2 培养箱中孵育 48h）
2. 胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。

3.800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复
两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。

4.用低速振荡器边震动边加入5 mL 预冷的 70%乙醇，固定， 4℃过夜。

5.次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃上清，加入 4 mL PBS 清洗一次，用
0.4 mL PBS 重悬细胞。

6. 加入 5 μL RNaseA（ 10 mg/ml ） 37℃消化 1
（propidium iodide PI ）4℃避光染色过夜（或者小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶37℃避光染色 1 小时），在 EPICS XL 流
式细胞仪上分析。

利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化
1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理
细胞。

2．胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。

3 . 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复
两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到 1.5 mL离心管中。

4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。

5. 1500rpm ，小型离心机离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 3 次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS 中。

6.分别将荧光二抗DyLight 488、DyLight 567 按照 1:100 比例加入细胞悬液中，室温孵育1
小时。

7.1500rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复
3 次，最后重悬细胞于0.2mL PBS中。

8.用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，在EPICS XL流式细胞仪上分析。

IR 检测
类型细胞NC 组NC 组NC 组 A 组 B 组 C 组
一抗无IgG1IR IR IR IR
二抗无DyLight 488DyLight 488DyLight 488DyLight 488DyLight 488目的空白对照同型对照实验组对照实验组 1实验组 2实验组 3
GLUT4 检测
类型细胞NC 组NC 组NC 组 A 组 B 组 C 组
一抗无IgG2a GLUT4GLUT4GLUT4GLUT4
二抗无DyLight 567DyLight 567DyLight 567DyLight 567DyLight 567目的空白对照同型对照实验组对照实验组 1实验组 2实验组 3
（因为 IR 和 GLUT4 同样为鼠源抗体，并且分开进行检测，二抗颜色可进行调试。

尽可能选
择效果好的同一种二抗。

可能使用一绿一红，也可能使用两个同样颜色的二抗）。