Reference
Crispr/Cas9 研究历史
1987
Ishino Y等在K12大 肠杆菌的碱性磷酸酶 基因附近发 现串联间隔重复序列
2002
该结构被正式定义为成簇、 规律间隔短回文重复序列（CRISPR）
2005
三个研究小组均发现 CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿 主菌的染色体外的遗传物质高度同 源
Cardiovascular Disease
Viral Diseases
Crispr系统应用
Wenhui Hu, et al. PNAS. 2014, 111(31):11461-6 CRISPR/Cas9 基因编辑技术能够有效利用其 sgRNAs 靶向作用于 HIV-1 原病毒 LTR(长末端重复序列) 区，对 HIV-1 原病毒进行有效 清除。在感染 HIV-1 的细胞中使用携带 2 个 sgRNAs
Easy: - all-in-one gRNA-Cas9 vector system - multi gene editing is feasible Mali et al., 2013 Cong et al., 2013 Jiang et al., 2015
Feasibility
Difficult: -Need a customized protein for each gene sequence -Low delivery efficiency Beerli et al., 1998 Perez-Pinera et al., 2012 Gaj et al., 2013 Moscou and Bogdanove, 2009 Boch et al., 2009 Gaj et al., 2013
基因编辑工具
ZFN
Target
Protein: DNA
TALEN
Protein: DNA
CRISPR/Cas
(gRNA-Cas9): DNA
Structure
Zinc finger DNA binding motifs in a ββα configuration, the α-helix recognizes 3 bp segments in DNA
CRISPR/Cas9 系统可以明显抑制病毒复制与再生效率。
Crispr系统应用
建立癌症模型
2015年，Zhang F与Phillip
A.Sharp团队构建了一个包含癌细胞系。将处理后的细胞接种
于免疫缺陷小鼠后，小鼠出现了 明显的肿瘤转移表型。 Chen SD ,et al. Cell. 2015 March 12; 160(6): 1246–1260
Crispr系统应用
体外培养的人类正常肠道成体干 细胞中通过CRISPR/Cas 引入 4 个结肠癌基因突变(APC、P53、
KRAS和SMAD4), 建立结直肠癌
类器官模型
Matano M, et al. Nat Med, 2015, 21(3):256–262.
Proteins containing DNA-binding domains that recognize specific DNA sequences down to the base pair
20nt crRNA (CRISPR RNA) fused to a tracrRNA and Cas9 endonuclease that recognize specific sequences to the base pair
(间隔相邻基序)
Cas9切割后的DNA修复
编辑效率检测
T7E1 Assays
sgRNA设计
功能
物种数 15 9
最大输入长度（nt） 23-500 不限
网址 /ZiFiT
CRISPR Design ZiFiT
设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估 脱靶效应评估 设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估
Cas9 Design
Cas-OFFinder E-CRISP CRISPR-P
10
25 33 33
不限
15-25 不限 23-5000

/cas-offinder /E-CRISP/index.html /crispr
CHOPCHOP
GT-Scan
23
专题内容
第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9
基因编辑技术
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术, 可以 精确地定位到基因组的某一位点, 并剪断靶标DNA片段
并插入新的基因片段
基因编辑工具
锌指核酸内切酶（ZFN）
类转录激活因子效应物核酸 酶（TALEN）
成簇、规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9 Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9（CRISPR/Cas9）
28
不限
不限
https:///index.php
http://gt-sቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ.au/gt-scan/submit
基因编辑流程
T7E1
Crispr系统应用
Cancer Genetic Diseases HIV
Immunodeficiency
2007
Barrangou 等首次发现并 证明细菌可能利用CRSPR系统对抗噬 菌体入侵。
2013
Zhang 研究组首次在人 293T细胞与小鼠Nero2A细胞中利 用 Crispr/Cas9系统实现了基因定点突变。
II型CRISPR免疫
II型CRISPR免疫
CRISPR系统结构
Crispr/Cas9系统核心：Cas9核 酸酶、sgRNA