5ˊ-G
AATTC-3ˊ
3ˊ-CTTAA +
G-5ˊ
3ˊ突出黏性末端(PstⅠ)：Leabharlann 5ˊ-CTGCA↓G-3ˊ
5ˊ-CTGCA
G-3ˊ
3ˊ-G↑ACGTC-5ˊ
3ˊ-G
+ ACGTC-5ˊ
平端缺口（钝性末端）( SmaⅠ）
5ˊ-CCC↓GGG-3ˊ 3ˊ-GGG↑CCC-5ˊ
5ˊ-CCC 3ˊ-GGG
是感染细菌的一类病毒 ，寄生于细菌中，并能溶解 细菌细胞，故称噬菌体。
26
噬 菌 体 生 活 周 期
27
28
3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。
4、病毒
29
第五节 重组DNA技术
30
基本步骤
目的基因的获取
↓
克隆载体的选择
↓
目的基因与载体 连接成重组DNA
↓
重组DNA导入受体菌
2.来源：原核生物
11
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。
Ⅰ型酶、Ⅲ型酶： 具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没
有多大的实用价值。
Ⅱ型酶： 应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切
割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
12
4.识别和切割位点：
↓
重组体的筛选
↓
克隆基因的表达 31
1、 制备目的基因
（1）化学合成： 已知目的基因的核苷酸序列或根据基因产物的氨基酸序
列推导出相应基因DNA碱基序列。 目前使用DNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小
CELLECTIS S.A. NASDAQ
1
2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功
2
基因组编辑技术简介
Genome Editing
3
2015.11.22 HuangCH @ J208
修改遗传信息的第一步： 按我们的设计来重组DNA
4
第一节 基 本 概 念
5
重组DNA技术：
是指在基因水平上，将目 的DNA在体外重组于能自我复制 的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生， 以获得大量的目的DNA片段，或 以此为基础，通过基因的诱导 表达，得到大量相应蛋白质产 物的过程。
识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列 。
通常是4～8个碱基对、具有回文序列的DNA片段 5’ – G A A T T C - 3’ 3’ – C T T A A G - 5’
13
① 5`突出粘性末端 ② 3`突出粘性末端 ③ 平头（钝性末端）
14
5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ)：
5ˊ-G↓AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ
又称为分子克隆技术或基 因工程技术
6
第二节 重组DNA技术的发展史
7
基因工程的诞生
1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组 猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA
1980年Nobel化学奖
2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功 1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年
17
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。 （1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身
连接，提高重组效率。 碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸 酶（CIP）。CIP能在 1% SDS溶液中68 ℃加热15 min而 失活，故CIP较为常用。
18
5、末端转移酶 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。
6、T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。 用途：⑴放射性标记DNA的5`端
⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 7、S1核酸酶
单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。
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pBR322质粒载体 ①相对分子质量小，长度为4.3kb。 ②含有氨苄青霉素和四环素的抗性 基因(Ampr和Tetr)。 ③有24种限制性内切酶位点。 ④有一个复制起始点（ori）及与 DNA复制有关的序列，赋予该质粒 复制子特性。 ⑤为松弛型复制子。
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2、噬菌体（bacteriophage,phage)
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
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3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外 切酶活性。
可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序 列分析等。
耐热DNA聚合酶 最适反应温度为75～80℃ 具有5ˊ→3ˊ外切酶活性，不具有3ˊ→5ˊ外切酶活性
克隆位 点，MCS）。
5、具有较高的遗传稳定性。
22
3、常用载体 质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋 予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一 的限制酶切点等。
23
1、质粒（plasmid）: 质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定 遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的 DNA分子。
8
第三节 工具酶
9
1、 “基因剪刀”－限制性核酸内切酶
Werner Arber 理论预见限制酶
Hamilton O. Smith Daniel Nathans 得到第一个限制酶 用限制酶切得
SV40 DNA片断
1978年Nobel生理或医学奖
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1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并 在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核 酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。
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第四节 重组DNA技术常用载体
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一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的 一类DNA分子。
分类： 克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外
源DNA片段。 表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因
表达产物。
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二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多
+
GGG-3ˊ CCC-5ˊ
切割方式：对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同缺口
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2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成 3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。
大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不 但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
ACG-OH TACTTAA-P