植物氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
植物氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂是一种旨在通过二甲基-4-亚硝基苯胺，受到单线态氧气-的作用，出现去色现象，由分光光度仪比色分析，定量检测植物组织细胞内单线态氧气活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），以及叶绿体等细胞器的单线态氧气检测。
可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。
其中单线态氧气（singlet oxygen；
1 O2）是分子氧（O2）的抗磁形式或电激发形式。
通过染料分子，例如孟加拉红（Rose Bengal）、亚甲基兰（Methylene Blue）、卟啉类化合物（Porphyrins）染料的光敏过程中能量转移产生，或过氧化氢和次氯酸的化学反应产生。
单线态氧气可以调节紫外线A辐射的生物学作用、激活各种细胞信号通路等。
单线态氧气会导致植物的光动力损伤（photodynamic damage）和动物心血管问题。
基于二甲基-4-亚硝基苯胺（N,N-Dimethyl-p-nitrosoaniline；PNDA或RNO）作为单线态氧气的选择性受体，在单线态氧气的存在下，产生去色作用，在分光光度仪下（440nm波长），呈现吸光峰值的降低。
据此定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的浓度。
产品内容
清理液（Reagent A）毫升
裂解液（Reagent B）毫升
缓冲液（Reagent C）毫升
反应液（Reagent D）毫升
阴性液（Reagent E）毫升
产品说明书1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
DOUNCE匀浆器：用于裂解植物组织
（微型）台式离心机：用于样品操作
培养箱：用于反应孵育
比色皿或酶标板：用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1．准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定500毫克组织重量2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．即刻用刀片切碎组织
5．放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6．加入预冷的xx毫升裂解液（Reagent B）
7．涡旋震荡5秒，充分混匀
8．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
10．小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
12．即刻移入到1.5毫升离心管
移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－MB30030.1）
14．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长440nm，并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）避免光照
三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升阴性液（Reagent E）
3．加入xx微升反应液（Reagent D）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在25℃温度下孵育40分钟
6．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照
四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入100微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
3．加入xx微升反应液（Reagent D）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在25℃温度下孵育40分钟
6．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数
五、计算样品浓度
[（样品读数－背景读数）X 1 （体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；毫升）X 34.4（毫摩尔吸光系数）]＝微摩尔1 O2/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔1 O2/毫克
六、酶标板测定
1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板的所有孔中
分别加入xx微升阴性液（Reagent E）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
4．分别加入xx微升反应液（Reagent D）到96孔板的所有孔中。