代谢指纹分析及其在微生物研究中的应用摘要：代谢指纹分析是新兴的代谢组学的主要研究方法之一，本文综述了代谢指纹分析的研究方法及其在微生物领域的研究应用进展。
关键词：代谢组学；代谢指纹分析；微生物代谢组学是20世纪90年代中期发展起来的一门对生物体或细胞等所有小相对分子质量代谢产物进行定量和定性分析的新技术。
这门新兴的学科凭借其整体论优势在最近几年得到了迅速的发展，广泛地应用到了功能基因组学、生物医学、微生物学等领域。
1.代谢组学简介代谢组学（Metabonomics或Mmetabolomics）是通过考察生物体系受刺激或扰动后(某个特定的基因变异或环境变化)其代谢产物的变化或随时间的变化，是研究生物体系代谢途径的新技术[1]。
Nicholson最初给出的定义是：定量测量生物体因病理生理刺激或基因改变引起的代谢应答变化[2]，系统性的代谢组学概念应将机体的代谢过程与微生物代谢以及外源环境因子的相互作用因素综合起来[3]。
研究过程中，逐步提出了一些相关概念，如代谢物靶目标分析(Metabolite target analysis)、代谢轮廓(谱)分析(Metabolic profiling analysis)和代谢指纹分析(Metabolic fingerprinting analysis)等。
2.代谢指纹分析的产生及原理20世纪80年代初，美国BIOLOG公司开发了一种新的微生物鉴定方法-代谢指纹法，并将其应用于微生物的自动化检测。
其原理是根据细菌对碳源（或氮源）利用的差异来区别和鉴定细菌，不同的细菌会利用不同碳源（或氮源）进入新陈代谢过程（称为呼吸），而对其他一些碳源（或氮源）则无法利用，将每种细菌能利用和不能利用的一系列碳源（或氮源）进行排列组合，就构成了该种细菌特定的代谢指纹，由于细菌在利用碳源进行呼吸时，会发生一系列的氧化-还原反应，产生电子，TTC（四唑紫，2,3,5-TriphenylTetrazoliumChloride）在呼收电子后，会由无色的氧化型转变为紫色的还原型，通过肉眼观察或计算机控制的读数仪，将反应结果同数据库中的指纹进行比对，从而得到细菌的鉴定结果。
3.代谢指纹分析技术研究进展代谢指纹分析系整体性地定性分析样品，比较图谱的差异快速鉴别和分类，而不分析或测量具体组分[4]。
3.1核磁共振技术核磁共振(NuclearMagnetic Resonance, 简称NMR)分析技术是利用物理原理, 通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质。
它不破坏被测样品的内部结构, 是一种无损检测方法[5]。
20世纪60年代, 核磁共振技术开始应用于代谢研究。
最初, 这类研究主要集中在医学领域。
直到20世纪70年代, 核磁共振技术才开始应用于微生物代谢研究。
利用高分辨率NMR技术对细胞内许多微量代谢组分进行检测, 可得到相应的生物体代谢物信息, 研究这些组分NMR的图谱, 综合分析这些信息所反映的生物学意义, 可以了解生物体代谢的规律[6]。
代谢组学中NMR方法的特点如下：(1)不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤，(2)可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，在接近生理条件下进行实验。
(3)可研究化学交换、扩散及内部运动等动力学过程，给出极其丰富的有关动态特性的信息；(4)可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样，(5)无偏向性，对所有化合物的灵敏度是一样的。
1H-NMR的化学位移范围只有10ppm，因此在3～5 ppm和6～8 ppm处有大量的氨基酸存在，图谱上可能出现上百个化合物的峰。
这些峰相互重叠、干扰，造成图谱解析困难，生物标物(biomarker)常受到与测定不相关物质的干扰，使NMR 难以发挥作用。
高分辨核磁共振(high-resolution NMR)则成为强有力的武器。
高分辨核磁共振仪具有较好的灵敏度，信号分散，图谱容易解析，可检测的核素有1H，13C，15N，19F，23N a，31P和39K等。
新发展的高分辨魔角旋转(HR-MAS)、活体磁共振波谱(MRS)和磁共振成像(MRI)等技术能无创、整体、快速地获得机体某一指定活体部位的NMR谱，直接鉴别和解析其中的化学成分。
1H-NMR和LC ／NMR成为代谢组学研究领域的最主要分析技术之一。
3.2 质谱技术由于代谢组学关心的是Mt<l 000的代谢产物，相对于NMR灵敏度低、检测动态范围窄等不足，现代质谱(MS)技术的优势是：(1)超微量，(2)快速(数分钟内完成1次测试)，(3)具有很高的灵敏度和专属性，可以同时快速分析多个化合物，(4)能同时提供样品的Mt信息和结构信息，(5)既可定量分析又可定性分析，(6)能有效的与各种色谱法在线联用，成为分析复杂体系的有力手段。
近年，随着质谱及其联用技术的发展，新一代MS也开始在代谢组学研究和代谢通量分析中倍受青睐[7-8]。
最新的质谱技术主要有傅里叶变换离子回旋共振技术(FT-ICR)、直接输注大气压电离化质谱技术(DIMS)、基于多孔硅表面的解吸离子化技术(DIOS)等。
3.3色谱技术色谱技术是几十年来分析化学中最富活力的领域之一[9]。
作为一种物理化学分离分析的方法，色谱技术是从混合物中分离组分的重要方法之一，能够分离物化陛能差别很小的化合物。
色谱技术最初仅仅是作为一种分离手段，直到2O 世纪5O年代，随着生物技术的迅猛发展，人们才开始把这种分离手段与检测系统连接起来，成为在环境、生化药物、精细化工产品分析等生命科学和制备化学领域中广泛应用的物质分离分析的一种重要手段。
全二维气相色谱(GC×GC)是将分离机制不同且又相互独立的2根色谱柱以串联方式连接在一起。
2根色谱柱之间装有1个起捕集再传送作用的调制器，将第1柱分离的组分由调制器聚集后以脉冲方式进入第2柱进一步分离，所有组分从第2根色谱柱进入检测器。
GC×GC与GC相比具有高分辨率、高灵敏度、高峰容量等优点。
袁凯龙等[10]建立了一种基于有机酸的SPME(自动固相微萃取)／GC×GC—FID指纹图谱分析方法，通过固相微提取，再行GC×GC—FID分析，比较了GC XGC和GC的分离能力，证明GC×GC可用于微生物的代谢指纹图。
3.4分析技术联用通过包括色谱(GC、LC)或毛细管电泳(CE)在内的多维分离技术，以及不同测定技术的联用可做到分析平台的优势互补。
此外，采用二维核磁共振(2D-NMR)可减弱复杂生物样品中大分子信号的干扰，提高小分子物质的检测能力。
随着NMR技术的发展，以前用于固体的魔角旋转(MAS)技术也移植到了液体领域，用来研究以前难以用液体NMR研究的样品，如器官组织样品。
利用MAS-NMR 技术可以得到完整的组织样品高分辨谱图，扩展了代谢组学研究的样品范围，同时可以更全面深入地研究一个系统。
4.代谢指纹分析在微生物研究中的应用代谢指纹分析检测方法操作简单并易获得微生物的生物化学信息，加上快速的自动分析鉴定系统，使其在微生物领域中有很好的应用前景。
Ishii 等[11]对计算机模拟的微生物的细胞模型进行了大规模的代谢组学研究，描述了微生物有组织的、无组织的、静止的、动态的等等数学模型，建立生化仿真平台对未知样本进行预测分析并开展代谢仿真等研究工作。
BIOLOG公司的基于代谢指纹法原理的细菌鉴定系统，在全球拥有二十多项专利，该系统在在96孔板条上实现95个反应，大大提高了鉴定的准确率，代谢指纹技术的运用，使该系统与传统的酸碱或细菌的生长反应相比。
细菌鉴定的范围更为广泛。
目前，BIOLOG的微生物鉴定系统不仅能够鉴定常见的肠杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、嗜血杆菌、厌氧菌、酵母样真菌、丝状真菌等近2000种微生物，几乎覆盖了所有重要的人体、动植物微生物和大部分环境微生物。
准确的代谢路径分析，需对酶进行活性化学反应计量法、生物信息法等全面测定[12]。
Fiaux等用13C 标记的和未标记的葡萄糖混合物观察大肠杆菌的微需氧代谢时发现，丙酮酸盐的C1～C2 链断裂、特征性丁酮二酸盐（通过磷酸烯醇丙酮酸盐羧化作用生成）和甲酸盐形成，证实了需氧菌的代谢活动与厌氧和需氧菌明显不同。
Boersma等通过19F- NMR 发现了微生物中氟苯异苯酚和羟基苯的代谢路径，并推测该路径可能与代谢型的表达相联系。
Wendisch等用代谢流分析技术结合核素标记方法，分析谷氨酸棒状杆菌的中心代谢路径，建立其代谢网络模型和预测模型。
Mogens等对乳酸菌的核苷酸代谢及其调控机制进行了研究，旨在提供乳酸菌代谢的生理学和遗传学概貌。
5.代谢指纹分析的发展方向目前，代谢指纹分析正处于快速发展阶段，日益成为研究的热点。
随着研究的深入，代谢指纹分析必将在微生物领域中发挥更大的作用，帮助人们更深地了解微生物生态系中各种复杂的相互作用，微生物细胞对环境和基因变化的响应，为人们提供一个了解微生物表型的独特途径。
高通量、高分辨率的分析技术与生物信息学相整合，对微生物代谢层面进行研究，提供了解微生物体的独特视角。
此外，代谢组学分析系统的硬件、软件技术将进一步提高，朝着整合化、自动化和高通量方向发展，使之以更快的速度对代谢指纹分析更大的部分实现自动分析和可视化。
利用代谢组学分析技术对用放射性核素标记的底物进行代谢产物流分析，将成为研究有关代谢产物生物合成或分解途径中的关键步骤及其基因调控机制的有效方法。
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