三种不同检测方法对诊断结核病的比较池云生张东浩吉林省结核病医院检验科 130500【摘要】目的将诊断结核病的蛋白芯片法与金标法及抗酸染色法三种检测方法进行比较，以评价三种方法在临床中的应用价值。
方法用蛋白芯片法、金标法及抗酸染色法检测125例确诊结核病人、50例肺部其它疾病患者和健康体检者的血清标本，并进行相关统计分析。
结果蛋白芯片法、金标法及抗酸染色法检出结核分枝杆菌的灵敏度为64%，72%及22.7%，前两者比较无显著性差异(P>0.05)，但均高于抗酸染色法(P<0.05)。
三者的特异性分别为90%，76.7%及96.7%。
结论蛋白芯片法检测结核分枝杆菌，与金标法及抗酸染色法比较，具有简便、快速、敏感性较高和特异性强等优点，是临床辅助诊断结核病的有效方法。
【关键词】蛋白芯片；结核分枝杆菌；比较；诊断结核病是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病，被列入我国法定重大传染病。
为了实现早发现、早诊断、早治疗的目标，临床上现已开展了多种针对于结核病诊断的实验室检测项目。
我院以开展的检测项目有蛋白芯片法、金标法、抗酸染色法、PCR-荧光探针法、结核菌培养等多种方法。
根据临床应用情况，现就相对简便易行的蛋白芯片法、金标法、抗酸染色法进行比较，来评价三种方法在临床中的应用价值，以便更好地为结核病防治的临床应用提供及时准确的信息。
结核蛋白质芯片(protein chip，PC)是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法，其基本原理是以微孔滤膜为载体，利用微阵列技术将纯化的结核菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)、蛋白16 KDa(rT—PA16)和38KDa(rTPA38)等三种抗原固相于同一膜片上，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫金作为标记物在膜上显色，然后放入芯片阅读仪，在专门软件的支持下对抗原点阵的灰度值进行分析，以达到检测结核分枝杆菌的目的。
为了评价此方法的临床应用价值，本文将此法与免疫胶体金法及常规的抗酸染色法作一比较，现报告如下：1 材料与方法1.1 材料①标本来源：125例确诊结核病人血清由我院内科肺结核确诊病人提供，50例肺部其它疾病患者和健康体检者的血清来源于本院胸外科、内科和门诊体检人员。
②主要仪器和试剂：蛋白芯片阅读仪、结核分枝杆菌蛋白芯片试剂盒均为南京大渊生物技术公司提供；结核分枝杆菌免疫胶体金诊断试剂盒为上海奥普生物医药有限公司产品；抗酸染色相关试剂，根据《全国临床检验操作规程》（第3版）由实验室自行配置。
1.2 方法1.2.2 蛋白芯片法：在芯片上标记上样品编号，在芯片盒窗口内滴加200μl 试剂A，使膜表面完全浸湿；将待检血清100μl加入窗口中，待血清完全渗入后，再滴加300 μl试剂B；待试剂B完全渗入后，滴加500 μl试剂C；待试剂C完全渗入后，最后滴加300μl试剂D；反应完毕后30 min内，将芯片放入芯片识别仪进行结果分析。
在确保没有开启任何应用程序的情况下，把芯片盒内的小光盘放人光驱，机器会自动进入“生物芯片检测软件”，然后按程序操作，并打印出分析结果。
结核杆菌3种特异性抗体，即抗脂阿拉伯甘露糖(LAM)、16KDa 及38KDa抗体，如果任一抗体检测为阳性，结果则判为阳性。
整个操作过程需30min左右。
1.2.2 金标法（DIGFA）：利用结核杆菌特异性外膜抗原，采用斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)原理进行检测，严格按说明书进行操作。
1.2.3 抗酸染色法(AFS)：参照《全国临床检验操作规程》第3版。
1.3 统计学分析概率的比较采用X2检验。
2 结果2.1 175例标本三种检测结果与临床诊断的关系见表1。
表1 175例标本三种检测结果比较分组# PC检出率（%）DIGFA检出率（%）AFS检出率（%）结核组125 64（80/125）72（90/125）22.7（33/125）对照组50 10（5/50）23.3（12/50） 3.3（2/50）注： P<0.05(与对照组比较)， P<0.05(与AFS法比较)。
2.2 三种检测方法的灵敏度、特异性比较蛋白芯片法、金标法及抗酸染色法检出结核分枝杆菌的灵敏度为64%，72%及22.7%，特异性分别为90%，76.7%及96.7%。
2.3 蛋白芯片法结核病组三种结核茵抗原的抗体构成比三种结核菌抗原的抗体阳性率以抗LAM 抗体的阳性率最高，为57.33％（72/125），其次为抗38KDa 抗体44％（55/125)，最低为抗16KDa抗体20%（25/125）。
三种抗体各组合结果见表2。
表2 结核病组三种结核菌抗原的抗体构成比LAM 16KDa 38KDa n 百分比（%）＋＋＋14 11.2＋－＋40 32＋－－15 12－＋－7 5.6－＋＋ 1 0.8＋＋－ 3 2.4－－－45 363讨论20世纪90年代以来，随着分子生物学在医学领域取得的飞速发展，研究者也将分子生物学的原理引入了结核试验研究范围。
自1989年其被引入结核病的诊断以来，立即成为结核病细菌学诊断领域中备受关注的焦点。
结核蛋白芯片即是利用结核菌的特异性细胞壁脂多糖抗原LAM 和经基因工程重组DNA 技术生产纯化的38KDa及16KDa特异性抗原固相于同一膜片上，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫金作为标记物在膜上显色，以用于结核病的临床检测［1］。
LAM 是分枝杆菌属细胞壁的重要组成部分，属特异性抗原，具有较强的免疫原性，其检测的灵敏度较高，但除结核分枝杆菌外，其它分枝杆菌也有LAM 成分，因此其特异性相对较低。
结核分枝杆菌38KD抗原与16KD抗原是结核分枝杆菌所特有的抗原，它与其它非结核分枝杆菌不存在交叉反应，其诊断的特异性较高［2］。
以上结果可见，结核分枝杆菌蛋白芯片检测结核的灵敏度为64%，特异性较高，为90%，与国内报道基本一致。
在125例结核病人中，有45例蛋白芯片法检测为阴性，导致其灵敏度降低，这可能是某些结核病人的血液中产生抗原和相应抗体复合物结合，导致游离抗体滴度降低，如低于设定显示疾病的cutoff值，则此时显示为阴性。
另外50例健康体检者中有4例蛋白芯片法检测为阳性，这可能是受潜伏结核或者环境中分枝杆菌污染的影响，或者是结核有效治疗后的个体其抗体依然存在多年所导致［3］。
金标法使用的是用现代生物技术提纯的结核分枝杆菌特异性外膜抗原，引进斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)原理，用于结核病IgG的检测。
本文显示的灵敏度和特异性分别为72％，76.7％，与相关报道基本一致。
从表1结果可看出，胶体金结核抗体法存在一定程度的假阳性和假阴性问题，假阳性的产生可能是人群感染结核杆菌十分普遍，部分人体对结核抗原反应较强所致。
另外就是金标法采用的是提纯的结核分枝杆菌外膜抗原，难免会和其它非结核分枝杆菌发生交叉反应。
假阴性产生的原因可能是：不同人群机体免疫水平存在差异；处于不同临床感染期的结核患者；血液中存在免疫抑制因子或抗原抗体复合物等因素，使机体血清中结核抗体水平产生差异，从而产生假阴性。
因此，在应用胶体金结核抗体快速检测法时，应结合临床症状与其它检查结果进行综合分析，并通过动态观察，从而进行临床诊断［4］。
在结核病的临床诊断方法中，抗酸染色法虽然具有简便、快速、特异性高的优点，是目前最主要的结核确诊手段，但其阳性率较低，约25 ～35％，还存在着大约65％～75%涂片阴性或培养阴性可疑结核病的诊断问题［5］。
从结果可见，结核分枝杆菌蛋白芯片阳性检出率48.57%（85/175）显著高于抗酸菌涂片镜检法20%（30/175），表明蛋白芯片结核抗体的检测对于不排痰的结核病患者或者涂片镜检阴性、不明原因的胸水、不能区别的结核病的鉴别诊断等具有重要意义，能显著提高检测的灵敏度。
另外在30例抗酸菌涂片镜检阳性标本中有2例蛋白芯片法检测为阴性，这可能是其它非结核分枝杆菌如戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌所导致，同时也证实了蛋白芯片法诊断结核病较为特异。
从表2可见，用LAM 和2种重组结核分枝杆菌蛋白抗原分别检测不同的病人其反应有所不同，究其原因，可能是因为结核分枝杆菌抗原多而复杂，在宿主体内表达的数量、种类或时机可能随病人的个体免疫背景和病程而异，从而表现出不同的抗原谱所致。
其中单一抗体阳性率是17.6%（22/125），两种抗体阳性率是35.2%（44/125），三种抗体阳性率是11.2%(14、125)，所有抗体阳性检出率是64%(80、125)。
因此，针对结核多种抗原的蛋白芯片法在保证特异性的基础上提高了检测的灵敏度。
综上所述，结核分枝杆菌蛋白芯片法诊断结核病，相对金标法及抗酸染色法而言，具有简便、快速、敏感性较高和特异性强等优点，是临床辅助诊断结核病的一种有效方法，值得在临床推广。
金标法检测试剂盒采用的纯化的特异性外膜蛋白抗原具有较高的免疫原性，特异性较强，本检测法虽为单孔测定，但由于根据结核病体液免疫反应规律，对诊断结核血清抗体水平的界值作了适当的调整，使其灵敏度不致太高，因而能有效地区别现症感染和既往感染，本文所测定结果与国内其他作者报告接近，基本达到临床诊断作用，对肺结核的治疗转归也有一定的监测作用［6］。
抗酸染色法检测结核杆菌的特异性高，但灵敏度很低，故一般用于临床以确诊病人的排菌监测。
参考文献：［1］朱中元，王海波，刘爱国，等．抗结核分枝杆菌多种抗原的抗体检测蛋白芯片研究．中国热带医学，2004，4(6)：907—910．［2］孔忠顺，管波清，古淑香，等．血清抗脂阿拉伯甘露糖及38kD抗体检测对涂阴肺结核及肺外结核诊断价值．中国防痨杂志，2002，24(3)：140—142．［3］李洪敏，王巍，吴雪琼，等．PBT—X2型识别仪在结核蛋白生物芯片中的应用．现代科学仪器，2005，2(1)：56— 58．［4］邱忠平，吴丽娟．胶体金试纸条快速检测结核抗体的临床意义探讨．国外医学临床生物化学与检验学分册，2004，25(3)：209— 210．［5］庄玉辉．加强结核病实验诊断新技术的临床应用研究．中华检验医学杂志，2001，24(2)：69—70．［6］陈俊林顾德林秦志华，医学文选 1999年第4期第18卷。