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人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定


1、层析过快,接取样品纯 度不够高; 2、上样量要适当,不要超 过柱的负荷能力。柱的负荷 能力可用交换容量来推算, 通常上样量为交换剂交换总 量的1%-5%; 3、洗脱液体积不足,导致 分离的各峰太过拥挤。
1、制胶不理想:浓缩胶长 度不够,可能导致条带过粗, 分离胶浓度过大会有拖尾现 象; 2、两板之间有气泡:条带 两边向下,中间鼓起; 3、电极不平衡:条带偏斜; 4、加样过多:条带两边扩 散。
编号 溶液名称 12%分离胶
1
2 3 4 5 6 总体积
30% Acr –0.8% Bis
pH 8.9 Tris -HCI 10%SDS TEMED 10%AP H2O
2.0ml
1.25ml 100ul 2.5ul 50ul 1.65ml 约5 mL
血清白蛋白相对分子量的测定
b. 浓缩胶的制备
在另一个干净的小烧杯中。 4.5%分离胶浓度,2.5 ml体积配制用量表:
②4℃,3000rpm离心15min,收集上清液。 ③用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5(即白蛋白的等电点),用量筒确定上清液的
体积,确定上清液的体积,计算加入饱和硫酸铵(pH=4.5)的体积(0.11×V)。
④逐滴加入饱和硫酸铵(pH=4.5),边加边振荡,4 ℃静置2 h。 ⑤4 ℃,3,000 rpm离心20 min,弃上清,沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸Na2HPO4缓冲液溶解。
编号
1 2 3 4 5 6 总体积
溶液名称
30% Acr –0.8% Bis pH 6.7 Tris- HCI 10%SDS TEMED 10%AP H2O
4%浓缩胶
0.33ml 0.63ml 25ul 2.5ul 12.5ul 1.5ml 约2.5 mL
血清白蛋白相对分子量的测定
c. 样品的处理: 向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液(Loading dye),充分溶解后,加盖(不要密闭),置沸水浴3 min, 取出冷至室温。 加样示意图:
04
预计实验结果
The expected experimental results
确定电泳取样的试管编号
标准蛋白质相对分子质 量(kda) 染料迁移距离(cm) 样品迁移距离(cm) 相对迁移率(mr)
标准蛋白质相对分子质 量对数(kda)
可以根据标准蛋白相对分子质量对数及相对迁移率做出标准曲线,以相对迁移率为横 轴,以标准蛋白相对分子质量对数为纵轴,预测应为一条直线。
Ⅲ.血清白蛋白相对分子量的测定:SDS-PAGE法
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋 白质分子量。 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小(分子量)有关,如电荷、形状都一 样,则电泳迁移率只与分子量有关。 SDS的作用: 1.能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂(巯基乙醇)能 使二硫键断裂,使蛋白质完全变性; 2.能与变性的蛋白质按比例结合,形成SDS-蛋白质复合物。 SDS-蛋白质复合物的特点:1. 由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态,从 而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异; 2.复合物都是椭圆棒状,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。 因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。
掌握血清白蛋白分离纯化的方法; 学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋 白质的原理与操作; 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的 原理和方法。
02
实验原理
The experimental principles
Ⅰ.血清白蛋白的初步分离
在半饱和硫酸铵溶液中,血清白蛋白不沉淀,球蛋白沉淀,离心后白蛋 白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多, 故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。 奈氏试剂是络盐 K2[HgI4] 加 KOH 的溶液,在无机化学定性分析中,用 其检验氨或铵盐
盐析过程中温度和pH的 控制不当,可能使得所 得目标产物白蛋白量较 少,影响后续测定。
离子交 换层析
SDS-PAGE法
盐析
可能出现的问题!!!
盐析
广泛使用的分离蛋白质的方法,所谓的盐析就是用大量中性盐 使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下,蛋 白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中和,因而破坏了蛋 白质溶胶的稳定因素,使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不会使 蛋白质变性,因此,若除去中性盐或减低盐的浓度,蛋白质就 可以重新溶解。
电泳预期效果
标准蛋白相对分子质量对数及 相对迁移率做出的标准曲线
05
可能结果偏差及解释
Possible result bias and interpretation
测得的人血清白蛋白分子量偏大 测得的人血清白蛋白分子量偏小
为 什 么 结 果 会 偏 大 ?
蛋白质的磷酸化
凝胶浓度不合适,蛋白质跑不动
人血清白蛋白的提取纯化 与分子量的测定
Loading……
1 1 2 2
实验目的及意义
实验原理 实验步骤 预计实验结果呈现形式
目录
Contents
3 3 4 4 5 5 6 6
可能结果偏差及解释
实验重点与难点剖析
01
实验目的及意义
The experimental purpose and meaning
表达的蛋白质提前终止了或者降解
SDS变性目的蛋白质不完全,使得蛋白质的 空间结构没有成为线型,构成了空间位阻 离子交换柱分离效果不好,杂质导致电泳 条带过宽,影响结果分析
为 什 么 结 果 会 偏 小 ?
人血清白蛋白是由 3 个结构相似的 α - 螺旋结构域组成 的,它们在 SDS 等的作用下,可能解离成亚基或单条 肽链。因此,SDS-凝胶电泳测定的不是完整分子的分 子量。
The experimental steps
I. 血清白蛋白的初步分离 II. 血清白蛋白的纯化
III.血清白蛋白相对分子量的测定
血清白蛋白的初步分离
1. 取样
取2ml血液,4℃,3000rpm离心15min,移取上清液(血清)1ml至10ml离心管。 2. 盐析
①量取9ml50%的饱和硫酸铵溶液,以移液管逐滴加入,同时不断振荡,4℃静置2h。
样品2 样品2 标准蛋白样品1 (Marker) 样品2 样品2
以微量注射器或移液枪加入10-20ul至样品槽内。
血清白蛋白相对分子量的测定
d. 电泳:点样端负极,恒压:开始80V,待样品进入分离胶后改为100V进行电泳, 待蓝色染料迁移至下端约 1cm 时,停止电泳,约需 1 ~ 2 小时。(电极缓冲液: pH 8.3 Tris –Gly) e. 染色:剥胶后加入考马斯亮兰R-250,染色20min。 f. 脱色:染色完毕,倾出染色液,加入脱色液。20~30min换一次脱色液,2~3次 后可初步观察电泳条带,然后脱色过夜,直至背景清晰。
血清白蛋白的纯化——离子交换层析
①装柱:将层析柱固定,保持垂直位。将浸胀的 DEAE- 纤维素装入柱内,至 810cm高度,平衡过夜(装柱时应注意均匀,凝胶内不得有气泡,凝胶床要平整)。 ②准备50-100支试管,置于自动收集器上;洗脱液经核酸蛋白检测仪监视,调节
流速为 1mL/min,蛋白质检测器调零。
血清白蛋白的初步分离
3. 透析
①将剩余的0.4 ml蛋白质溶液将透析袋中,放入pH 7.4的柠檬酸Na2HPO4缓冲液中,搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4+存 在。 ②NH4+的检测(奈氏试剂检测):取1 ml透析液,加入5滴奈 氏试剂,混匀,观察,如果出现砖红色沉淀,说明仍有NH4+存 在,需继续透析。
该法测定蛋白质分子量的局限性:
1.蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如胰凝乳蛋白酶)组成的,测定时只 是它们的亚基或单条肽链的MW。 2. 电荷异常的蛋白质(如组蛋白,带大量正电荷)。 3.结构异常,不于分子量呈线性关系(如胶原蛋白)。 4.带有较大辅基的蛋白质(如糖蛋白)。
03
实验步骤
血清白蛋白相对分子量的测定
g. 计算
通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下:用直尺分别量出样品区带 中心及染料与凝胶顶端的距离,按下式计算: 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)。 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图,得到标准曲线。根据待测样品的相对迁 移率,从标准曲线上查出其相对分子质量
血清白蛋白
血清白蛋白约占血浆蛋白总量的 60% ,水溶性很强,结构稳定, 能结合多种小分子,如脂肪酸,胆红素,血红素等,起维持血 液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及 血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用,在医学临 床及生物领域应用广泛。可以根据不同蛋白质的相对分子质量、 溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来分离及提纯各种 蛋白质。
Ⅱ.血清白蛋白的纯化:DEAE-纤维素阴离子交换剂
离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。 本实验采用的是DEAE-纤维素阴离子交换剂(中强碱型),可电离基团是二乙基氨 基乙基,适用于大分子的分离。在离子交换层析中,蛋白质对离子交换剂的结合力 取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引,而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。 因此,蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和 pH来完成,对离子交换 剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来 。除硫酸铵后的白蛋白溶液在 0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下,加到二乙氨乙基(DEAE )一纤维素层 析柱上,在此pH 时,DEAE 一纤维素带有正电荷,它能吸附带负电荷的白蛋白、α 及β 球蛋白(血清白蛋白等电点为4.5,绝大多数,α 及β 球蛋白等电点均小于6 )。 随着盐离子浓度的提高,离子交换柱上的β -球蛋白、α -球蛋白、白蛋白依次被洗 脱下来。
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