基因表达技术
2007年5月16日09:43 生物技术世界
目前，基因表达已经成为生物学、医学和药物开发研究中的主流技术。

基因表达就是基因转录及翻译的过程。

广义来说，基因表达有两类：分析型和功能型。

前者是指检测和定量基因，尤其是在比较两个样本时，如处理/非处理，疾病/正常。

功能型的基因表达，目的是获得一定数量的蛋白质。

Invitrogen公司的JudyMacemon称，在她的顾客中，对研究基因功能的基因表达/敲除感兴趣的人是采用基因表达制造蛋白质的人的两倍。

cDNA过度表达优势大
经典的基因表达操作常对病变细胞或组织、以及用药治疗之后的情况进行比较。

为了验证某种化合物对基因的效果，研究人员用siRNA或反义化合物返回去做敲除试验。

这些技术可以让基因或者基因组表现出特殊的沉默现象。

OpenBioSystems公司的PaulTodd博士指出，虽然基因敲除很流行，但它不是证实基因性能的唯一方法。

Todd博士把cDNA过度表达称之为基因敲除的“合理逆转”。

siRNA是让基因沉默，以确定基因下游的效应，而cDNA 引入许多目标基因的复制样本，引起基因及其下游产物都超表达。

很多时候，从cDNA获得的信息要比siRNA的信息要更好，Todd认为这与设计无关。

采用siRNA方法，研究人员必须确定短寡聚核苷酸序列，该方法可以最佳方式敲除目标基因。

并非所有的寡聚物都能发挥效用，因此，就无法做到把所有基因的反应都准确预测出来。

通常要敲除20~80%的序列，采用cDNA会出现过表达现象，这样就可以提供足够的目标基因用于插入。

Todd认为，cDNA可以确保产生更多的信使RNA，也就会产生更多的蛋白质或下游产物。

cDNA优于siRNA的主要优势在于前者具有更广泛的潜在应用范围，可以用股票的短期销售或者是长期交易进行比喻。

短期销售只可能赚到原来的股票价格，然而，长期购买，股票可能会翻两倍或者是三倍。

siRNA试验的信号只限制于基因原始状态的性能，因为可能从最高水平降低为零。

cDNA能正调节一个基因的性能，而且，把目标基因与绿色荧光蛋白相融合，可以直接观察到在活细胞中产生的蛋白质及其分布位置。

基因表达在药物发现上有许多应用。

在最近纽约科学院的一次会议上，Avalon制药公司副总裁PaulYoung向大家
展示，使用简单的基因信号或标记可以对新的候选药物进行鉴定。

Young及其团队首先观察到，在各种疾病的试验细胞中，siRNA敲除“坏因子”引起的特定的基因表达，并对观察到的现象进行了验证。

采用标准的基因微阵列，他对基因进行了活化以及去活化，然后挑选了5~20个变化最稳定或者是可预测的基因。

根据这些基因的活性，Young构建了一个“条形码”，作为断裂途径或者是目标的特异性分子标记。

用新化合物对这组基因进行测试，与在药物发现过程中被敲除的基因具有类似的活性。

传统的药店称毫不会怀疑自己应用这些技术的能力，因为他们不需要知道药物靶标的知识。

基因表达数据库加速研究
GeneLogic公司的DonnaMendrick博士认为，要解释基因表达的差异，背景内容很重要。

他说：“许多大型数据库的价值就是了解一个参数的正常的差异性。

在一个涉及数千个样品的实验中，你可以看到大量的基因变化或者是差别，结果可能显得很异常，但是这不能代表一切，因为可能只是一个特殊的基因波动较大罢了。

”
GeneLogic公司维护着世界上最大的动物和人体组织产毒基因表达数据库。

档案资料由活组织检查样品中的人体基因表达构建，数据来自于临床部分，或者是标准的鼠肝细胞毒理学和基因表达数据。

利用这些数据资料，公司构建了统计学上有效的可预测模型，可以对候选药物进行优先次序排列，调查生物标记，或者是用于毒理学机制的研究。

客户也可以在两个数据库中调查与预测性研究和临床研究都有关的过渡性生物标记。

在基因组时期的黑暗时代（大约8年前），方法要比现在慢得多，可靠度也更低。

基因芯片提供了一个高水平测试方法。

因为高通量方法不是真正的高通量，因此像基因芯片那样的工具就很昂贵，为了保证统计数据的可信度，生物学家需要不停的思考每个数据点所需的组织样品或动物的数量。

许多实验人员相信，通过数据整合，他们能克服那些统计学上的难题。

国际生命科学协会健康和环境研究所（ILSI）的Mendrick博士认为，这样做主要还是因为成本问题，他们都认为不能采用统计学方法，除非真正存在重复并且测量到这些结果。

自制芯片难敌批量产品
自微阵列技术最初开始出现以来，学术机构以及部分企业的研究团体都是自己制作自己的基因和蛋白质微阵列。

一旦研究团体拥有自己的点阵设备，芯片成本就可能转变为试剂、基质底物和研究生的工作时间。

除了节约研究经费之外，自制芯片的灵活度要更大，可以为某些特殊的生物体、组织或有关基因和蛋白质定做芯片。

俄勒冈健康科学大学神经学教授PeterSpencer等人的研究结果表明，自制的基因表达芯片是不可靠的。

在去年发表的一篇文章中，Spencer等人发现，从使用结果来看，市场上销售的基因芯片产品要比大学实验室自制的芯片更好。

点样技术、仪器使用以及技术人员操作水平的差异，导致了一块芯片与一块芯片之间，一批产品与一批产品之间的高变异性。

Spencer认为，只有所使用的技术是可靠的并且是可重复的技术，得出的结果才是可信的。

研究数据表明，在早期的微阵列研究中，大部分的科学家采用的是自制芯片，因此发表的研究结果与批量制造的芯片相比，可能会显得比较特殊。

在Spencer看来，制造厂家在产品的制造控制方面要做得更好，尤其是在芯片-芯片的可重复方面。

他们不断的改进，使微阵列变成了高科技产品。

如Illumina生产的微珠芯片产品，以寡聚核苷酸微珠为基础，微珠通过自组装随机固定到蚀刻的孔中。

微珠芯片是一种基于光导纤维的芯片系统，在直径3.5mm的光纤束中，有约50,000根光纤。

在每根光纤的顶端蚀刻出一个洞，可以镶嵌3um的小珠。

每束光纤可镶嵌1,536种小珠，每种有约30个重复。

瞬时表达系统多快好省
瞬时的基因表达系统至少发展了20年的时间。

其实研究的思路很简单：把一个基因快速的插入一个细胞，并且希望该基因能找到通往细胞核的途径，在细胞核中，细胞的结构将把它的序列转换为RNA，并且最终转化为蛋白质。

瞬时表达系统利用了整个转染过程，包括试剂，从感染细胞的病毒，到把基因插入到核中的机械装置及技术。

只要转染细胞系还有活力，它们就能产生蛋白质，这个过程通常很短，在转染后很快就爆发出强大效应。

因为外源基因不是细胞基因组的成分，所以新基因不能传给后代。

在转染3~5天内，瞬时技术可以产生成百上千的蛋白质。

根据参数来看，实际的产量可能会有所改变，会比细胞培养多得多。

近10年来，宾夕法尼亚州立大学的WayneCurtis教授一直从事快速转染基因表达技术的研究，把基因递送到植物组织生物反应器中生长，2004年获得了专利。

系统采用了缺乏1种或更多种生长因子的土壤杆菌属营养缺陷型突变菌株。

通过一种特殊的t－DNA传递体机制，重组质粒转化脓杆菌把基因转入植物中。

Curtis表示，研究小组正在设法创建杆状病毒系统__用于组织培养的瞬时转化表达载体，可以快速的获得所需蛋白质。

Curtis认为，作为一种生产平台，瞬时的基因表达无法与固定转染相竞争，但细胞培养的顶级科学家FlorianWurm 博士认为两者可以进行比较。

Wurm成功构建了2个简单的转染系统，根据磷酸钙系统，把基因转入哺乳细胞中，并且把规模扩大到了100升。

基因表达推动药物研究
最重要的是基因表达研究在哪里都不过时。

在后基因组时期，大家对基因表达的兴趣迅速升温。

即使是美国FDA，也正打算采取行动。

2005年3月，当局发布了一份针对制药企业的《药理基因资料审查》指导，该文件也许是过去10年来最重要的药物管理准则。

在文件中，FDA鼓励制药公司定期将产生的基因组信息数据提交给FDA。

至少在目前，当局不会根据药物基因组学数据提供的不利信息就把正处于研究阶段的新药物应用研究终止掉，因为可能说明药物具有毒性或是在某种基因型中的效果更差，那些数据其实对新药物的应用是不利的。

FDA似乎对制药公司使用药物基因组学数据十分上心，其实是为了生产更好更安全的药物。

GeneLogic的DonnaMendrick认为，推出这个指导，表明当局已经把基因表达技术真正应用到“活”的化合物上了。

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（译自《BioscienceTechnology》）。