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4.2 DNA顺序的组装
• 噬菌体P1载体：与λ载体相似，由于P1载体的基 因组要大于λ噬菌体基因组，并且其颗粒也比噬 菌体大，故可以P1载体克隆更长的DNA片段。 • BAC：是基于大肠杆菌的野生型F质粒设计的。BAC 可用于克隆300kb左右的片段。 • PAC：结合P1载体和BAC所设计的，其容量也可以 达到300kb。 • 在搭建克romosome walking）
鸟枪法的运用
• 2002年中国科学家在绘制籼稻基因组工作框架图的过程中， 采用的是全基因组鸟枪测序法。植物基因组有大量的重复 序列，重复序列的正确识别和组装，因此需要开发特殊的 计算软件。 • 首先在整个水稻基因组上生成许多已知长度的DNA切片， 然后使它们按DNA序列的重合区域进行排列。这些切片数 量足以覆盖水稻基因组４次。接着，确定每个切片的碱基 对序列，并用计算机程序将其组装成更长的片段，然后将 这些片段排序、装配成１０万多个被称为支架的更大组件。 • 设计出的软件重点是通过支架水平上的接近来进行组装， 并采取了独特的重复序列处理算法，可识别并暂时屏蔽占 水稻基因组约40％的重复序列。这样做的好处是既能减少 计算量，又最大限度降低了错误拼接的可能性。
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4.2 DNA顺序的组装
染色体步移的原理：在开始时，验室
4.2 DNA顺序的组装
的DNA序列查找与之连接的克 隆建立重叠群，直到覆盖整个DNA片段，甚至染色 体 • 拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群，先进 行各个BAC克隆的随机测序，再进行序列组装
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4.2 DNA序列的组装
• 将大量短的DNA序列组装
– 直接鸟枪法 – 克隆重叠群法
– 引导鸟枪法
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• “全基因组鸟枪法测序”也称“霰弹法”，是将基因组DNA 打成小片段进行测序，随机测序
直接鸟枪法的原理和特点
• 直接鸟枪法序列组装：从已测序的小片段中寻找彼此
重叠的测序克隆，依次向两侧邻接的序列延伸，组装成一 个完整的基因组。 不需预先了解任何基因组的情况，即 使缺少遗传图或物理图也可完成整个基因组顺序组装。 • 鸟枪法的最大优点是经济、快速、高效，但对高性能计算 的方法和设备要求非常高。 DNA
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A. 双脱氧链终止法
• 原理：
–DNA复制： 模板DNA、DNA聚合酶、引物、4种dNTP –ddNTP的加入：在反应系统中加入双脱氧（碱基）核苷三 磷酸（ddNTP），只要双脱氧核苷酸掺入3’ 端，该链就 停止延伸，链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延伸。 如此得到3’端终止于ddNTP的一系列长度不等的核酸片段 –4个反应体系中分别加入4种不同的ddNTP，浓度低于 dNTP。反应终止后，分四个泳道进行电泳（聚丙烯酰胺 凝胶），分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个 碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，可依次阅读合成片 段的碱基排列顺序。
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PCR制备单链DNA
A.双脱氧链终止法
• 通过M13载体获得单链 DNA以测序： 是利用M13噬菌体在 体外能以单链形式存 在。将待测序DNA片段 连接到M13载体中去， 再利用引物，进行DNA 合成，并在合成系统 中加入ddNTP
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A.双脱氧链终止法
• 双脱氧链终止法中引物的影响：引物决定 了模板链的测序起点，一般来说，是采用 克隆位点附近载体上的一段顺序。
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A.双脱氧链终止法
双 脱 氧 链 终 止 法 测 序 的 原 理
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• 双脱氧链终止法对DNA多聚酶的要求：
– 高酶活性 – 无5 ’－3 ’外切核酸酶活性，5 ’－3 ’外切核酸酶使 DNA聚合酶去除已存在的链 – 无3 ’－5 ’ 外切核酸酶活性， 3 ’－5 ’外切核酸酶 使DNA聚合酶校正自身错误
A.通用引物：与载体DNA中 附近插入片段的顺序退火， 可引入新链的合成。 B.内部引物：提供一系列端 部以及内部可完成长序列顺 序的克隆。
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B.化学降解法
• 基本原理：在选 定的核苷酸碱基中 引入化学基团，再 用哌啶处理使DNA 分子在被修饰的核 苷酸位置降解。
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同时完成4组反应，A、G、C、T 链终止法：主流技术，易于机械化自动控制 化学降解法：试剂含有毒性主要原因是链终止法。
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• 2000年6月26日，美国总统克林顿(中)、塞莱拉公司董事 长兼首席科学家克雷格· 文特尔(左)和人类基因组计划首 席科学家弗胡西斯· 柯林斯(右)在华盛顿白宫参加庆祝人 类基因组草图绘制成功。
实例： TIGR测定流感嗜血杆菌基因组
• 主要步骤： • 1.建立高克隆片段的碱基 总数应达到基因组5倍以菌基因组的测定完成，使用了14台 测序仪，用三个月时间完成了必需的28,463个测序反应， 测序总长度达6倍基因组（1830kb，11631kb）。 • 3.序列集合。发展了新的软件，修改了序列集合规则以最 大限度地排除错误的连锁匹配。 • 4.填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板 DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未测序的序列 DNA
组装的大分子 DNA
完整的基因组 DNA
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鸟枪法的运用
• “鸟枪法”是美国塞莱拉遗传公司创始人克 雷格· 文特尔发明的，是目前常用的两种DNA 测序法中较为快捷的一种。传统的DNA测序 法要将DNA片段放大，并在克隆的细菌中对 其测序，过程繁琐复杂。 • 2000年塞莱拉公司和国际合作项目“人类 基因组计划”分别通过这两种方法绘制出 人类基因组草图。
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鸟枪法的缺陷
• 对比利用“鸟枪法”绘制的人类基因组草图和 “人类基因组计划”公布的最新草图进行了，发 现“鸟枪法”无法测到人类基因组中重复出现的 DNA片段，这些片段占到基因组的3%至5%，对于理 解遗传性疾病具有重要意义。 • 但在进行快速DNA测序时，“鸟枪法”仍然不失为 一种可取的手段。最佳的DNA测序法是，将两种测 序方法相结合：用“鸟枪法”进行整体测序，识 别出“鸟枪法”无法测序的区域，再通过传统方 法对这些区域测序。
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实例：果蝇基因组的鸟枪法测序
• 第一个完全采取鸟枪法完成基因组测序的真30kb
–10kb长度足以覆盖果蝇基因组中大多数重复顺序，可 在序列组装时找到单一顺序连接真实的重叠克隆 –130kb便于大范围序列组装，有效建立全基因组的物理 图框架
A.双脱氧链终止法
• 天然的DNA聚合酶不能满足，需要进行改造
– Klenow聚合酶：来自大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，外 切酶活性去除，酶活性不够，250bp – 测序酶Sequenase：噬菌体T7编码
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A.双脱氧链终止法
• 双脱氧链终止法要求单链作为模板：
– 将DNA克隆到质粒载体中：碱变性或热变性变为单链 ，双向测序；污染，干扰 – 以M13载体克隆单链DNA：无需变性，直接测序； >3kb，扩增时容易发生丢失与重排，小片段DNA测序 – 以噬菌粒（phagemid）克隆DNA：改造的质粒载体 ，2个复制起始点（质粒自身和 M13单链噬菌体）， 在大肠杆菌细胞中产生单链噬菌粒， >10kb DNA测序 – PCR产生单链DNA
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列通 拼过 接覆 流盖 感不 嗜同 血序 杆列 菌重 的叠 全群 基之 因间 组间 序隙 列的 序
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实例： TIGR测定流感嗜血杆菌基因组
• 鸟枪法测序的缺点 随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量 增加。高等真核生物（如人类）基因组中有大量 重复序列，导致判断失误。 • 对鸟枪法的改进 (1) Clone contig法。首先用稀有内切酶把待测 基因组降解为数百kb以上的片段，再分别测序。 (2) 靶标鸟枪法(directed shotgun)。首先根据 染色体上已知基因和标记的位臵来确定部分DNA片 段的相对位臵，再逐步缩小各片段之间的缺口。
测序技术的发展
• 放射性同位素标记底物：灵敏度高 • 荧光标记物：灵敏度与分辨力，便于仪器阅 读。一种碱基一种颜色（A红色，G黄色，C 蓝色，T绿色） • 毛细管电泳：取代聚丙烯凝胶平板电泳，96 个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实 验不到2小时，1天可完成近千次反应
• 光点测序pyrosequencing：无须电泳，每 连接dNTP时释放1个焦磷酸，焦磷酸在磷 酸化酶的作用下转换为化学能，发出光亮 。每次只加入1种dNTP • DNA芯片测序：将各种排列顺序的寡聚核 苷酸点在芯片上，DNA分子与芯片温浴， 能杂交的寡聚核苷酸都会在确定位置发出 信号，获取信息进行对比组装。
基因组测序与序列组装
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基因组测序与序列组装
• 基因组计划的最终目标是获得所研究的生物的完 整的DNA顺序。最佳状况是将物理图谱和遗传图谱 进行有机整合，以确定基因以及其他重要的序列 在DNA顺序中的位置。 • 主要内容： • 1.DNA测序的方法 • 2.DNA序列的组装 • 3.基因组测序的其他路线 • 4.人类基因组的测序和组装
最新进展：经济快捷的DNA染色测序法
2005年4月，美国columbia大学的科学家给4种碱基染 上不同的颜色，然后从人类p53基因中抽取一个由12个碱 基组成的片段，运用分子生物学技术使染色的碱基排列成 与该DNA片段互补的一个新片段。 • 传统DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测序和焦磷酸测 序等，这些方法技术要求较高、成本昂贵，而且容易出错。 相比而言，新方法通过逐个观察DNA片段上碱基的颜色来 确定其序列，精确度极高。 • 对这项研究提供资助的美国国家人类基因组研究所希望， 在10年内将哺乳动物的基因测序成本从1000万美元降低 到1000美元，这样就有可能以廉价的成本对患者进行“量 身定做”的基因治疗。
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4.2 DNA序列的Biblioteka 装• 克隆重叠群的序列组装