医学细胞生物学实验教学大纲实验一显微镜的操作与使用3学时实验二有丝分裂3学时实验三鸡血细胞融合3学时实验二有丝分裂【目的要求】(1)掌握动、植物细胞有丝分裂过程各期的特点及主要区别。

(2)掌握有丝分裂标本临时压片技术。

【实验原理】细胞经过生长和分裂而完成增殖的全过程称细胞增殖周期。

不同分裂方式的细胞其增殖周期表现形式不同。

无丝分裂是低等生物增殖的主要方式，由于其过程简单而迅速，没有染色体组装、纺锤体形成等一系列变化，故又称直接分裂。

在高等动物体内可发生在某些迅速增殖的组织f如口腔上皮)、体外培养细胞，创伤修复、病理性代偿组织(伤口附近、炎症)中。

有丝分裂是高等生物体细胞增殖的主要方式，由于其过程较为复杂，细胞内发生一系列复杂的丝状结构变化(染色体组装、有丝分裂器的形成)后，细胞才进行分裂，故又称为间接分裂。

【实验用品】(1)器材：显微镜、载玻片、盖玻片、眼科镊、培养皿、刀片。

(2)试剂：Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)，70％乙醇溶液，1mol／L HCl苯酚品红染液。

(3)标本：马蛔虫子宫切片、洋葱根尖纵切片。

(4)材料：洋葱根尖或水仙根尖。

【内容与方法】(一)动物细胞有丝分裂观察(1)标本制备：马蛔虫子宫石蜡切片，铁苏木精染色。

(2)观察：先在低倍镜下观察。

在马蛔虫子宫切面上可见子宫腔内有许多近圆形的受精卵细胞，大多处于不同的分裂时期。

每个受精卵细胞外均围有一层厚的受精卵膜，它与受精卵细胞间的空隙为围卵腔。

在有些受精卵细胞外表面或受精卵膜内可见有极体附着。

注意在切片标本的几个子宫切片中寻找和观察处于间期和有丝分裂不同时期的细胞，转换高倍镜仔细观察它们的形态变化(图6---2)。

间期(interphase)：细胞质内有两个近圆形的细胞核，二为雌原核，一为雄原核。

两个原核形态相似，不易分辨。

细胞核内染色质分布比较均匀，核膜完整，细胞核附近胞质中有中心体(central body)存在。

前期(prophase)：雌雄原核相互靠近，核仁(nucleolus)消失，染色质逐渐浓缩成扭曲细丝状染色丝(chromatin fiber)，进一步缩短变粗，形成短棒状染色体(chromosomc)。

前期核膜消失，两对中心粒(centri0le)分离，周围出现星射线并分别向细胞的两极移动。

中期(metaphase)：染色体排列在细胞中央，形成赤道板(equatorialplate)。

由于细胞切面不同，此期有侧面观和极面观两种不同图像。

侧面观染色体排列在细胞中央，两极各有一个中心体，其周围有星射线。

中心体之间纺锤丝与染色体着丝点相连，这些结构总称为有丝分裂器。

极面观可见六条染色体平排于赤道面上，此时染色体已纵裂为二，但尚未分离。

后期(anaphase)：纵裂后形成的子染色体在纺锤丝的牵引下分别向两极移动，成为相等的两群。

细胞拉长，中部的细胞膜开始凹陷。

末期(telophase)：两极的子染色体逐渐解体、模糊，变成染色质态。

核膜、核仁也相继重新出现，纺锤丝星射线消失，细胞膜的凹陷加深，最后横缢成两个子细胞。

(二)植物细胞有丝分裂观察1．洋葱根尖纵切片的观察(1)标本制备：洋葱根尖石蜡纵切片，铁苏木精染色。

(2)观察：取洋葱根尖纵切片标本．在低倍镜下观察，洋葱根尖由尖端向上可分为三个区域。

1)根冠区：位于尖端，细胞排列较疏松的区域。

2)生长区：位于根冠区上方，细胞方形或扁方形，排列紧密，细胞有强烈的分裂增生能力，大都处于分裂期的各个不同时期。

3)延长区：位于生长区上方，细胞延长成长方形，细胞多处于分裂间期。

先在低倍镜下找到生长区，换高倍镜观察，辨认处于不同分裂时期的细胞。

间期：细胞核内染色质分布均匀，核形态明显，核内可见l一2个染色很深的核仁。

前期：核膨大，核膜破裂，核仁逐渐消失，核内染色质浓缩成纤细的染色丝．并逐渐缩短变粗，形成染色体。

中期：染色体排列在细胞中央平面上(赤道部)形成赤道板(洋葱染色体为16条)，染色体己纵裂成两条染色单体，但依然由一个着丝粒相连。

细胞两极出现纺锤丝，部分纺锤丝与染色体着丝点(kinetochore)后期：着丝粒纵裂，染色体分为相等的两群，在纺锤丝的牵引下移向两极。

末期：移到两极的染色体解旋、伸长变细成为染色丝，最后形成染色质。

核膜、核仁重新出现，纺锤体消失。

细胞中央赤道部由纺锤体微管等形成成膜体(phragmoplast)，由它再融合成细胞板(cell plate)，进而形成细胞壁，形成两个子细胞。

2．洋葱根尖(或水仙根尖)临时压片观察(1)标本制备：1) 取材：培养洋葱(或水仙)，取根尖，将其浸入Carnoy固定液2h以上。

然后保存在70％乙醇溶液中(可长期保存)。

2)软化：观察前取出根尖，浸在lmol／L HCl溶液中软化5一lOmin，水洗3次。

3) 染色：将以上处理的根尖放在滴有一滴苯酚品红染液的载玻片上，用眼科镊捣碎根尖，稍停片刻后，盖上盖玻片。

4)压片：轻压盖玻片，把材料压成均匀的薄层。

用吸水纸吸干盖片周围的染液。

(2)观察：先用低倍镜寻找压片中处于分裂期的细胞。

然后在高倍镜下观察不同分裂期的细胞。

染色质和染色体被染成紫红色，细胞质不着色。

各期细胞形态表现同上。

【作业】1．书写实验报告，简述制各根尖临时压片步骤，并绘图记录洋葱根尖有丝分裂各期细胞。

2．绘制马蛔虫受精卵有丝分裂各期细胞。

【思考题】简述动物细胞与植物细胞有丝分裂有何异同。

【试剂配方】苯酚品红：融化的石炭酸25ml加入50ml 95％乙醇溶液中，5g碱性品红溶解于其中，充分溶解后过滤，4"C保存。

使用时用蒸馏水稀释至500ml，成熟1周。

实验三鸡血细胞的融合两个以上细胞合并成一个双核或多核细胞，称为细胞融合(cell fusion)。

细胞融合包括质膜的连接与融合，胞质合并，细胞核、细胞器和酶等互成混合体系。

20世纪60年代初期，病毒诱导细胞融合技术的出现，开创了人工诱导细胞融合的新领域。

70年代后，逐渐使用化学融合剂，它使用方便，活性稳定，容易制备和控制，目前已成为人工诱导细胞融合的主要手段。

80年代初,出现了电融合技术，它具有可控、高效、无毒的优点，并逐渐应用于科学研究。

细胞融合技术广泛应用于细胞生物学、遗传学、病毒学、肿瘤学的研究。

例如，细胞周期调控的研究，基因互补分析、检测病毒，细胞对病毒敏感因素的分析、肿瘤细胞恶性分析等等。

单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，对生命科学的研究及医学方面的应用产生了重大影响。

本实验主要介绍化学融合剂聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)介导的细胞融合。

[目的要求](1)了解PEG诱导细胞融合的基本原理。

(2)通过PEG诱导的鸡红细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合技术。

[实验原理]PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。

PEG可与水分子借氢键结合,在高浓度(50％)的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，引起细胞融合。

为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG 溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。

因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。

本实验材料为鸡红细胞，其核结构紧密，易于观察。

[实验用品](1)器材：离心机、显微镜、天平、水浴锅、计数板、滴管、离心管、容量瓶、广口瓶、细口瓶、烧杯、注射器、盖玻片、载玻片。

(2)试剂：Alsever溶液、GKN溶液、0.85%盐水、双蒸水、Jenus green染液、50％PEG。

试剂配制：1)Alsever溶液：葡萄糖2.05g,，柠檬酸钠0.80g, NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中。

2)0.85％生理盐水。

3)GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.40g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红(phenol red) 0.01g，溶于1000ml双蒸水中。

4)Janus green染液。

5)50％PEG溶液：称取一定量PEG(WM＝4000)放入烧杯，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混匀，置37℃备用。

（3）材料：成年鸡。

[方法与步骤](1) 注射器内先吸入2m1 A1sever溶液，从鸡翼下静脉取2m1鸡血，注入离心管，再加入6ml Alsever溶液，使之成为1∶4悬液。

(2) 取l ml鸡血悬液，加入4 m1 0.85％生理盐水，混匀平衡后，800 r/min离心3min，弃去上清液，再按上述条件离心2次。

最后，弃去上清液，加GKN液4m1，离心1次。

(3) 弃去上清液，加GKN液（体积比1∶9），制成10％细胞悬液。

(4) 取以上悬液以血细胞计数器计数，若细胞密度过大，用GKN溶液稀释至(3~4)×107个/m1。

(5) 取以上细胞悬液1ml于离心管，放入37℃(39℃左右更佳)水浴锅中预热。

同时将50％PEG液放入水浴锅中预热。

(6) 待温度恒定后，在1ml细胞悬液中慢慢逐滴加入0.5m1 50％PEG溶液(慢慢沿离心管壁流下融合剂)，且边加边摇匀，然后放入水浴锅中。

(7) 细胞融合一段时间(20—30min)后，加入GKN溶液至8m1，静止于水浴锅中20min左右。

(8)取出离心管，800r/min离心3min，使细胞完全沉降。

弃去上清液，加GKN溶液，再离心1次。

(9)弃去上清液，加入少量GKN溶液，混匀，取少量悬液于载玻片上，加入Janus green染液，用牙签搅匀，3min后盖上盖玻片，观察细胞融合情况。

[观察与结果](1)在显微镜下，观察细胞融合情况，计算融合率。

(2)融合率＝视野内发生融合的细胞核总数／视野内所有细胞核总数×100％[作业]1．书写实验报告，并计算融合率。

2．绘图显示所观察到的融合细胞。

[思考题]1．细胞融合率受哪些因素的影响?2．在进行细胞融合时，要注意那些问题?。