医学医疗：Image?Pro Plus图像分析软件定量鸡胚尿囊膜血管新生面积的方法 2009-5-12 15:35:58 点击：QQ次发送给好友和学友门交流一下收藏到我的会员中心保过辅导免费试听考试用书考试宝典经验交流模拟考试【摘要】目的应用Image Pro Plus 5.0图像处理和分析软件，研究鸡胚尿囊膜 (chic k chorioallantoic membrane，CAM) 血管新生面积定量的新方法。
方法 20只发育良好的7日龄鸡胚，分为龙葵给药组和对照组，每组10只。
将中药龙葵水提液及等量蒸馏水吸附于5 mm直径的定性滤纸，置于CAM上。
利用Image Pro Plus 5.0软件，定量血管新生面积、蛋壳开窗处对应的CAM面积，计算出血管新生面积与CAM面积的比值。
结果用Image Pro Plus 5.0可方便、自动、准确地进行给药前后的数据收集和面积计算。
统计分析表明，受试物龙葵可明显抑制CAM血管新生，与对照组比较有极显著差异(P<0.001)。
结论 Image P ro Plus 5.0图像处理和分析软件是一种高效、准确的统计血管新生面积的工具，用该软件定量蛋壳开窗部位下的血管新生面积占开窗部位所对应的CAM总面积，不仅操作简便，而且数据计算自动生成，可较准确地反映鸡胚血管新生情况。
【关键词】图像分析 Pro Plus 5.0 血管新生定量鸡胚尿囊膜Quantitation of Angiogenesis in Chick Chorioallantoic MembraneUsing Image Pro Plus SoftwareXU Yang1，ZHAO Ying kai2，BI Ming gang1，LIU Yan3(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Scie nces and PekingUnion Medical College，Beijing 100094，China; 2.Institute of information on Traditional Chinese Medicine，China Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700；3.Beijing Uni versity of Chinese Medicine，Beijing 100029)【Abstract】 Objective To evaluate the value of method for quantitation of angiogenesis in chick chorioallantoic membrane (CAM) using Image Pro Plus 5.0 software. Methods Twenty well developed eggs were divided into two groups wit h 10 in each group: the Solanum nigrum group treated with 10 μL of its water ex tract，and the control group applied with the same volume of distilled water，re spectively，absorbed on a piece of filter paper. Image Pro Plus 5.0 imaging so ftware was used to quantify the angiogenesis with the vascular area，the total C AM area under the egg shell opening，the ratio between vascular and CAM area. Results Image Pro Plus 5.0 software could be used to delineate and calculate th e angiogenesis area and CAM area under the open egg shell window automatically a nd accurately. The angiogenesis was significantly reduced in the Solanum nigrum treated CAM compared with that in control group (P<0.001). Conclusion ImagePro Plus 5.0 is an effective tool for evaluation of angiogenesis in CAM model s．The percentage of angiogenesis area vs. CAM area can be used to reflect angio genesis in CAM models simply and quatitatively.【Key words】 Image analysis，Software，Image Pro Plus 5.0; Quantitation，angiogenesis; Model，Chick chorioallantoic membrane鸡胚尿囊膜 (chick chorioallantoic membrane，CAM) 血管新生模型已成为研究抑制和促进血管新生物质的作用效果的经典手段之一。
通过众多的研究者的不断改良，造模方法渐趋完善。
但是，在判定CAM上新生血管的面积方面，出现了数种方法并存的局面。
为了寻求一种快速、准确，易于操作的方法，我们应用广泛使用的Image Pro Plus (版本5.0) 图像处理和分析软件，对于CAM模型中的血管面积定量方法进行了研究。
1 材料和方法1.1 仪器种蛋培养箱系上海跃进医疗器械厂生产，实验室用超净工作台系苏州净化设备厂生产，Image Pro Plus 5.0软件为Media Cybernetics公司出品。
1.2 受精种蛋购于中国农业大学实验动物研究所，每只55～65 g。
1.3 测试药物取龙葵茎叶100 g，以沸水浸泡提取3次，每次用水2 L，30 min。
过滤，合并提取液，于水浴上蒸发浓缩至40 mL，即得2.5 g/mL 龙葵生药的提取液。
给药时离心除去沉淀，用0．45 μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。
以定性滤纸为样品载体，用打孔器制成5 mm直径大小的纸片，灭菌冷却后于超净台内，将滤纸排列于无菌铝箔上，分别加入10 L (灭菌蒸馏水稀释，含生药20 mg) 龙葵药液，空白对照组只加入等量灭菌蒸馏水。
滤纸样品均在超净台内风干。
1.4 CAM模型按参考文献方法［1］进行造模。
20只发育良好的7日龄鸡胚，随机分为龙葵给药组和对照组，每组10只，将种蛋表面用酒精消毒后，在超净台内用镊子在蛋胚顶端小心戳一小口，然后剥去周围的蛋壳和壳膜，使开口约为（1.5×1.5）cm大小。
小心地用微型手术镊子从气室与卵黄囊分隔处挑破气室膜，轻轻去除上层的气室膜，暴露位于气室膜下层的CAM。
将载样滤纸置于CAM 和卵黄囊膜处血管较少的部位，然后用灭菌透明胶封口，继续在37℃和60%的相对湿度下进行孵育48 h。
1.5 血管新生面积统计孵育完毕后，去除鸡胚气室端密封的透明胶，小心地用镊子从气室端揭去周围的蛋壳，最大程度暴露CAM 便于观察和拍照。
体视显微镜接Nikon 4500数字相机，拍摄给药部位，保存图象文件。
用图像处理软件Image Pro Plus 5.0读入保存的图象，进行数据收集及计算。
1.6 统计学方法所有数据输入计算机，利用SPSS软件，根据资料要求进行方差分析。
2 结果2.1 血管新生面积的定量及数据收集（1）将存于计算机中的数字相机所摄图像文件，用图像处理软件Image Pro Plus 5.0打开，点工具条上的Manual Measurements图标，出现Measurem ents对话框，鼠标点Feature下面虚框中的不规则多边形图标处，鼠标移动到图像中，在所摄鸡胚CAM图中画出准确的蛋壳开窗大小所对应的CAM部位，软件即刻算出所定义的开窗部分的面积 (图1，A和D)。
（2）鼠标点工具栏处的Ir regular AOI (不规则的感兴趣区域) 图标后，再以鼠标在第一步标示好的CAM 位置处重叠画出相应的范围。
然后，点工具栏上的Measure按钮，在弹出的下拉菜单中选取count/size项，新出现一个对话框，选择Manual手动方式，点sel ect colors按钮，选color cube base，通过鼠标选取血管处以定义血管范围，图像软件自动为选取的血管标上颜色 (图1，B和E)。
关闭当前对话框，回到c ount/size，鼠标点对话框中的count按钮，软件就立即算出相应的血管面积 (图1，C和F)。
2.2 Image Pro Plus 5.0对给药后CAM血管新生的面积的定量龙葵给药后，肉眼观察，CAM上给药载体旁边新生血管数明显减少(图2A)。
而对照组可见CAM上的载体周围血管排列成车辐状生长，类似树叶的叶脉状分布，大血管和小血管都明显发育(图2B)(图1，2见彩插)。
应用Image Pro P lus5.0，根据上述所示的方法进行新生血管面积定量。
结果表明，给药组血管新生面积为10.78%±1.42%，对照组血管新生面积为22.78% ±1.91%。
与对照组比较，给药组血管新生面积明显减少(P<0.001)(图3)。
图3 龙葵对鸡胚血管新生面积的影响。
用Image Pro Plus 5.0对给药组(n= 10)及对照组(n=10)血管新生面积与气室开窗部位所对应的CAM面积进行统计，分别计算百分比。
数据以均值±标准误表示。
*P<0.0013 讨论鸡胚尿囊膜血管新生模型由于操作简便、灵敏度高、研究成本低廉等方面的优势，在肿瘤血管新生、血管新生因子、以及抗血管新生的复合物等研究方面得到了广泛的应用［2-6］。
对于鸡胚血管新生的定量，目前的研究中常采用以下3种方法：(1) 计数给药后CAM上的血管数［7-8］；(2) 观察给药后有否产生无血管区域［3］；(3) 利用图像分析仪算出CAM上新生血管的面积，计算血管生成抑制率［10］。