连续色谱和电喷雾电离质谱分析法对草鱼肌肉水解物的抗氧化肽的纯化和鉴定任娇燕a,赵眸明a,*, John Shi b,王金水a,江月明c,催春a，Yukio Kakuda a ,Sophia Jun Xue ba轻工与食品科学学院，中国科技大学，广州510640，中国b圭尔夫食品研究中心，农业和农业食品,加拿大圭尔夫，安大略省，加拿大N1G5C9c华南植物园，中国科学院研究所，广州，乐意居510650，中国d食品科学研发部，圭尔夫大学，圭尔夫，安大略省,加拿大N1G2W12007年5月9日收到，2007年11月5日收到修订表格，2007年11月7日接受。

摘要用多种蛋白酶（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，牛胰酶6.0，中性蛋白酶为1.5mg和碱性蛋白酶2.4L）水解草鱼肌肉以提取抗氧化肽。

用羟自由基的清除能力和抑制脂质过氧化活性的方法来评估水解能力。

准备过程中发现，用2.4L碱性蛋白酶的水解具有最高的抗氧化活性。

使用超滤和连续的色谱法来纯化，包括离子交换色谱法，多层线圈高速逆流色谱法，凝胶过滤色谱法。

纯化的多肽，作为一种强有力的抗氧化剂，可以使用在线RP-HPLC的电喷雾电离质谱确定丝氨酸-赖氨酸-色氨酸- 谷氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸- 缬氨酸（966.3 Da）。

当然，才发现基本肽比酸性或中性肽有更大的清除羟自由基的能力，水解的疏水肽比亲水性肽贡献更多的抗氧化活动。

此外，氨基酸中其抗氧化活性的肽序列可能发挥重要作用。

关键词草鱼肌肉抗氧化肽，高速逆流色谱，电喷雾电离质谱分析。

1介绍氧化在所有活的生物体中都是一种重要的反应。

氧化代谢过程中自由基和其他活性氧（ROS）的形成是不可避免。

这些活性自由基，起到重要的信号转导作用（汉考克，Desikan，奥尼尔，2001年）。

然而，过剩的自由基对生物组织和食品能造成破坏性的影响（王，赵，赵江，2007）。

在所有ROS中，羟基自由基被认为是最活泼的，并能在接触到活细胞的过程中破坏几乎任何化合物（卡斯特罗弗里曼，2001）。

自由基链式反应可以启动膜脂质过氧化作用，这已被证明与许多疾病相关（哈勒威尔，2001年哈利维尔及怀特曼，2004）。

脂质过氧化导致食品风味和口感变坏，保质期减少并形成潜在的毒性产品（Pihlanto，2006年）。

合成抗氧化剂：如叔丁基对羟基茴香醚（BHA），丁基化的羟基甲苯（BHT），叔丁基氢醌（TBHQ），没食子酸丙酯已被广泛应用于延迟食品因氧化引起的变质（Wanita & Lorenz, 1996）。

然而，由于其潜在的健康危害，他们被限制在一些国家（贝克尔，1993;膜，1975）。

其结果是，安全和自然存在的抗氧化剂作为人造替代品的需求已经稳步发展了许多年。

近年来，各种蛋白质的消化产生的生物活性肽的抗氧化活性已经吸引了很多注意。

从牛奶中的肽（布兰卡安娜·卢尔德＆Isidra，2007年），大豆（吉布斯，Zougman，穆利根，2004），米糠（帕拉多等，2006），油的种子（阿鲁科MONU 2003），鸡蛋（坂橘石原慎太郎Juneja，2004）和猪（赛加羚羊的，2003年）都被证明具有抗氧化活性。

此外，水产品和副产物已被证明是良好的抗氧化肽来源。

例如，来自蛋白（Amarowicz沙希迪，1997），鲭鱼蛋白（吴，陈，萧，2003），巨型鱿鱼皮（门迪斯，拉贾帕克萨，卞金，2005年），无须鳕帧蛋白（JE，金，2007年）和唯一的黄帧蛋白质（6月，公园，荣格2004年）的毛鳞肽的研究曾报道存在显着的抗氧化活性。

然而，据我们所知，很少有研究已经完成对淡水鱼衍生肽的抗氧化性能测试。

草鱼是高产淡水鱼之一，目前在中国的总淡水鱼高达35-40％。

然而，草鱼增值产品的发展没有得到充分利用。

因此，从低使用率的草鱼制备抗氧化肽可能是生产高价值的食品配料的方法之一。

氨基酸序列（陈，村本，山口，藤本，Nokihara，1998年）的抗氧化活性与肽是密切相关的。

众所周知抗氧化肽具有一些金属螯合或氢/电子还原活性，这可能使他们与自由基和终止自由基链反应，或形成保护（Wang等，2007）。

疏水性氨基酸和一个或多个氨基酸：蛋氨酸，胱氨酸，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸和蛋氨酸被认为可以增强抗氧化肽的活动（陈，村本，山内溥，Nokihara，1996; Da'valos，米格尔·巴托洛梅Lo'pez，2004;莱德斯马Herna0ndez，Da0valos Bartolome0，2005年）。

然而，最近的一些研究结果重新阐明了这个主题。

例如，最近报道谷氨酸-亮氨酸肽残留在清除自由基中发挥重要的作用（军等，2004）。

因此，已知的抗氧化肽，甘氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸-精氨酸，不包含任何上述质子在其序列的氨基酸残基中有所贡献（李，陈，王，吉武，2007）。

似乎确实需要更多的研究来澄清肽结构与功能的关系。

高速逆流色谱法（HSCCC）作为有效的分离技术，已成功应用于天然产物化合物包括类黄酮，香豆素（Haqiwara，1997年）和皂素（Jerz Waibel的，2003年）的分离（鹏，范，吴，2005年）。

高速逆流色谱主要使用在分离游离肽的标准混合物（马伊藤，1997），虽然很少对水解产物中的肽这样做。

这项研究的目的是确定和评估或表征低利用率的淡水鱼草鱼的抗氧化肽。

此外，采用高速逆流色谱分离水解物中的肽对于隔离来自其他蛋白质的肽可以提供有用的信息。

2材料与方法2.1材料在中国广州，从本地市场获得健康的草鱼（草鱼，822±147克的重量，40.8±2.8厘米长）。

草鱼（不包括头，尾，皮，骨，内脏器官和血液），在绞肉机MM12（韶关，食品机械有限公司，中国）上切片并形成肉末。

肉末材料冷冻并储存在20℃的温度以进一步使用。

用于水解实验的食品级酶（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，牛胰酶6.0，中性蛋白酶为1.5mg和碱性蛋白酶2.4升）由诺和诺德公司（中国北京）和明远有限公司（广州，中国）提供。

用于凝胶过滤层析分子量校准的标准蛋白混合物由（GE，新泽西州Piscataway，，美国）提供。

所有HPLC级氨基酸混合标准，谷胱甘肽（GSH），氧化型谷胱甘肽（GSSG），甲基叔丁基醚（MTBE），异硫氰酸苯酯（PITC）和乙腈，购自Sigma公司（北京，中国）。

α-脱氧核糖（2 - 脱氧-D-核糖），购自Fluka公司（瑞典斯德哥尔摩）。

所有其他试剂均为分析级。

2.2草鱼肌肉的制备解冻冷冻的草鱼肌肉肉末（1250克）并与离子水（1250毫升）混合水解。

获得的混合物五等分。

用0.01M NaOH调节至所需的pH值，并在水浴中加热到应用（表1）的每一个的级分所需的温度。

木瓜蛋白酶，牛胰酶6.0，菠萝，1.5mg的中性蛋白酶和碱性蛋白酶2.4L 溶解在去离子水中，并根据活性（见表1）按适当的比例进行添加。

水解反应在摇床中进行（新不伦瑞克省，中国科学C24）。

水解结束时，将混合物在沸水中加热10分钟以灭活蛋白酶。

在GL-21M冷冻离心机以4125g（湘怡仪器有限公司，长沙，中国）离心水解物30分钟，然后上清液冻干，保存在干燥器中以进一步使用。

表1处理五个蛋白酶酶解草鱼肌肉水解和抗氧化活性的参数样品酶水解的参数水解物的抗氧化活性（IC 50）（毫克/毫升）活性（U/克）酸碱性时间温度E/S ratio (w/w) HRSAA LPIAB 木瓜蛋白酶2.4 *1047.0 4.0 50.0 1.5/1000 3.54 ±0.21a 5.53 ±0.37a 牛胰酶6.0 6.0 *104 8.0 4.0 50.0 1.0/1000 2.34 ± 0.39b 5.76 ±0.45a b 菠萝蛋白酶3.0 *104 7.0 4.0 50.0 2.0/1000 5.02 ± 0.35c 7.03 ±0.48b 中性蛋白酶1.5mg 3.0 *104 7.0 4.0 50.0 2.0/1000 4.09 ± 0.39ad 6.67 ±0.58ab 碱性蛋白酶2.4L6.9 *104 8.0 4.0 50.0 1.5/1000 1.81 ± 0.44c 4.60 ±0.39abc GSH 1.75 ± 0.20c 3.21 ±0.47c*以±SD表示一式三份。

其次根据配对样本检验在同一列中相同的字母的值没有显着性差异（P> 0.05）。

A指氢氧自由基清除能力（HRSA）B脂过氧化的抑制活性能力（LAEA）2.3抗氧化活性的评价对于抗氧化试验，用冻干的水解产物溶解在去离子水中制备五个不同浓度水解产物的样品溶液（1.0，2.0，3.0，4.0和5.0毫克/毫升）。

2.3.1羟自由基的清除能力（HRSA）检测HRSA检测已经在大泽，Kawakishi（1997）先前一些修改过的论文中说明过。

将反应混合物0.1毫升10mM的硫酸亚铁，0.1毫升的10mM EDTA，0.5毫升的10mM-脱氧核糖，0.9毫升的磷酸钠缓冲液（pH7.4）和0.2ml的样品中，充分混合在反应罐中。

然后把过氧化氢（0.2毫升，10毫摩尔）加入到反应混合物中，在37度温育1小时。

把1毫升2.8％三氯乙酸（TCA）和1.0毫升的1.0％硫代巴比妥酸（TBA），加入到试管中，煮沸15分钟。

冷却后，该混合物中，在532 nm处测量吸光度。

磷酸钠缓冲液（pH7.4）而不是样品作为对照空白。

HRSA 脱氧核糖氧化羟基自由基的抑制率为：HRSA（%）=*100 （1）其中A0指空白的吸光度，A1指试验化合物的吸光度。

对个别样品的浓度的HRSA值进行绘制。

清除50％的自由基活性的浓度被定义为的IC50值。

2.3.2抑制脂质过氧化活性检测（LAEA）根据吴，刘，王（2000）和大川，大石，八木（1979）描述的与修改的方法进行了LAEA检测。

体重200-250 g的雄性大白鼠从南方医科大学（中国广州）动物实验中心获得。

大鼠都可以免费获得食物和水，用戊巴比妥钠（62毫克/千克）进行牺牲实验。

从所得材料迅速解剖肝组织，并在研钵中加Tris-HCl缓冲液（40mM，pH7.0）匀化，以产生2.5/10（重量/体积）腹部匀浆。

匀浆（100Ⅱ）和0.06 mM的维生素C（100Ⅱ），30mM的氯化钾（100Ⅱ）样品孵育（200Ⅱ），0.16 mM的硫酸亚铁（100Ⅱ）在37度孵育1小时。

然后加（1毫升0.67％TBA和1毫升15％的三氯乙酸）。

这最后的溶液加热到100°C并在沸水浴中保持15分钟，在冰上冷却10分钟，然后6445g速度离心10分钟。