成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室许秀芳 李温斌* 陈宝田* 吕燕宁 赵莉敏 陈 燕提要:为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法,应用生物酶(5g/L胰蛋白酶及1g/L胶原酶)灌注法分离成年大鼠心肌细胞,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。

结果:心肌细胞的存活率为91.7%;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比约为4~6 1。

结果提示:该方法是比较理想的心肌细胞培养法。

关键词:成年大鼠心肌细胞;胰蛋白酶;胶原酶;分离技术中图分类号:Q253;R322.1+1自从1953年Durrows和M oscona首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后[1],其分离培养技术不断发展,逐渐发展为3种分离方法:离体心脏灌注法、心肌细胞浸泡法和贴块培养法。

对动物而言,离体心脏生物酶灌注法分离心肌细胞的质量及数量最佳。

成年心肌细胞的分离较幼年及新生动物心肌细胞的分离更为困难,但成年心肌细胞做为一种生物学实验工具是其他心肌细胞不可替代的。

国内仅有少数单位分离培养成功成年动物心肌细胞。

1992年1月至1998年12月,我们建立了成年大鼠心肌细胞分离培养方法并进行了形态学观察。

1 材料和方法1.1 材料实验动物为成年Wistar大鼠,体质量150~200g,由本研究所实验动物室提供。

DMEM培养液、胰蛋白酶均购自美国GIBC公司;胶原酶购自美国Sigma公司;牛血清白蛋白购自美国BM公司;胎牛血清由金华生物制品公司提供;淋巴细胞分离液由中科院血液学研究所出品;安贞号心脏停跳液由本院体外循环组提供。

实验药物及试剂的配制:2%胎牛血清20 mL加DMEM培养液100mL,青霉素100mg/ L,链霉素100万U/L,pH7.2~7.4,过滤除菌。

酶消化液:胶原酶0.1g加胰蛋白酶0.5 g、牛血清白蛋白1g,加入DM EM培养液100 mL,于使用前配制。

1.2 方法采用离体心脏灌注法分离心肌细胞[2,3]。

Wistar大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(含1 200肝素45mg/kg),麻醉满意后胸腹部用75%乙醇消毒,!U∀字形切开腹壁,快速剪断左右前腔静脉及后腔静脉,经升主动脉根部灌注4#高钾安贞号心脏停跳液30m L,待心脏停跳呈灰白色后取下心脏,接在Langendorff 灌注架上,按下列步骤进行实验:1)清洗心脏:用无Ca2+、Mg2+的D H ank 液灌洗心脏5m in即可;目的是解离桥粒和细胞间连结。

由于Ca2+在心肌细胞连结上起重要作用,用无Ca2+的液体灌洗心脏能带走大量的Ca2+,心肌细胞间糖蛋白被破坏,桥粒和连结随之解离。

2)溶解细胞外基质:应用酶消化液37#灌注,保持灌注压在4.90~7.84kPa(50~80 cmH2O)。

3)心肌细胞的释放:经一定时间(30~90 min)酶消化后,心肌细胞外基质大部分被消化,但细胞间连结如缝隙连结并没有完全断开,心脏仍保持大体形态,松弛状,机械作用才能将细胞分开。

见心脏变软、呈暗红色,取下心脏,轻揉搅拌几分钟后剪下心室肌,剪成1mm3大2000年 6月第21卷 第2期首都医科大学学报Journal of Capital U niversity of M edical SciencesJun.2000V ol.21 N o.2收稿日期:1999 03 09*首都医科大学附属北京安贞医院心外科小的组织碎块或呈匀浆状,用200目钢网过滤,D Hank 液冲洗,收集滤液。

4)心肌细胞的收集和Ca 2+耐受的建立:细细胞的密度高,加适量的D H ank 液后,低速离心(800g ,15min)可分离低纯度的心肌细胞,去上清后加入D H ank 液与Hank 液的混合液(1 1)适量,800g 离心,15min,去上清后加入Hank 液洗1次,以上过程称为!复钙∀。

5)心肌细胞的进一步纯化:离心分离的心肌细胞仍混有一些其他细胞,如内皮细胞、成纤维细胞,用梯度离心法,Ficoll 分离液分离,心肌细胞沉在最低层,将沉底的心肌细胞用2%牛血清白蛋白(BSA)悬起,800g 离心,20min,心肌细胞沉在低层,用DM EM 完全培养液配成2∃106mL -1。

6)心肌细胞的培养和形态学观察:心肌细胞50 L 加DMEM 250 L,加样于96孔培养板,共16孔,另取心肌细胞1mL 加DM EM 完全培养液2mL 于50mL 培养瓶中,两者均于37#5%CO 2条件下培养,每天换培养液1次。

细胞培养96h 后观察心肌细胞的形态并照相。

取出培养瓶中的细胞800g 离心后再用2%的BSA 液悬起,再离心后心肌细胞用5%戊二醛固定,尽快做透射电镜检查。

7)心肌细胞质量评价:于心肌细胞培养1d 后应用形态学及台盼蓝(trypan)染色法做心肌细胞质量评价。

方法为取8孔心肌细胞做台盼蓝染色,镜下观察心肌细胞形态并计数1000个心肌细胞,杆状未着色者为存活的心肌细胞,计算心肌细胞的存活率。

2 结果心肌细胞形态观察:培养1d 后经台盼蓝染色证实为存活的心肌细胞静止贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比为4~6 1。

培养3d 后心肌细胞内混杂的少量红细胞已经死亡,混杂的白细胞、成纤维细胞、内皮细胞等经3次换液后已极少,培养4d 后的心肌细胞做光镜及电镜检查,电镜照片示心肌肌丝清楚,肌节明显,线粒体清楚,无明显水肿,无空泡化(图1、2)。

培养1周后心肌细胞形态同前,未见明显分化。

培养板各孔心肌细胞的存活率结果见表1。

图1 成年Wistar 大鼠单个心肌细胞电镜片 在DM EM 完全培养基中培养4d,示心肌细胞肌节清楚,线粒体丰富,无明显水肿、空泡化 ∃15600图2 成年Wistar 大鼠单个心肌细胞电镜片 在DM EM 完全培养基中培养4d,示心肌细胞肌节清楚,线粒体丰富,无明显水肿、空泡化 ∃52000105第2期许秀芳等:成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察表1 心肌细胞存活率*孔号活细胞数/个存活率/%192392.3291291.2389189.1495195.1590290.2693293.2788988.9892692.6总计66791.7*每孔的细胞数均为1000个3 讨论本研究采用离体心脏灌注法,用Ficoll分离液梯度离心分离成年大鼠心肌细胞,用离体心脏灌注法即取出动物心脏,经升主动脉根部灌注生物酶以消化心肌细胞间质从而分离心肌细胞。

常用的生物酶有胰蛋白酶及胶原酶。

胰蛋白酶主要用于分解组织间质的蛋白成分,作用较强,同时对心肌细胞膜蛋白亦起较强的破坏作用,故对酶的质量浓度及作用时间要求严格,质量浓度多为1~20g/L,本研究为5 g/L,作用时间应取决于酶的活性及质量浓度,一般在10~60m in。

应根据心脏的形态、色泽判断心肌细胞分离的情况,并及时应用牛血清白蛋白来中和消化。

胶原酶作用较缓和,主要用于消化细胞间质中的胶原纤维以释放心肌细胞,它可和胰蛋白酶同时应用或分开使用,应用效果各家报道不同,尚无一致意见。

本研究同时应用胰蛋白酶及胶原酶分离心肌细胞,存活率达到91.7%,培养1周存活良好。

另外还可缩短心肌细胞的分离时间,减少心肌细胞缺血时间,便于心肌细胞的存活。

生物酶灌注法由于其分离心肌细胞的效果及质量较好,现已广泛应用,但必需具备一定的分离技术方可分离出大量的完好心肌细胞,对实验条件、技术要求较高。

由于要求取下完整的心脏,该方法难用于人心肌细胞的分离,是其一大缺点。

心肌组织浸泡法即应用生物酶浸泡已被剪成极小碎块(1mm3)的组织,应用生物酶渗入细胞间质以分离出心肌细胞,由于在酶渗透过程中,对心肌细胞间质作用时间的不均一性,对外表的心肌细胞破坏严重,故分离心肌细胞的效果较差,但该方法便于用于人心肌细胞的分离。

关于贴块法,主要用于新生动物心肌组织,将心肌组织剪成1mm3大小之碎块,置于培养液中,利用新生心肌细胞易生长的特性,依靠心肌细胞的分化生长出单个心肌细胞。

该方法用于成年动物效果差,很少使用。

心肌细胞的培养方法类似于一般细胞。

培养液多选用DM EM、Medium199、William液,并加入10%~20%的胎牛血清或小牛血清。

关于血清的用途及机制目前尚不十分清楚,可能为提供粘附底物和一些必需的营养物质如生长因子、激素等。

培养液的pH值为7.35~7.45,细胞生长过程中养分的消耗和代谢产物的聚积可导致培养液pH值稍有降低,可利用培养箱中CO2含量(5%)来缓冲培养液的pH值。

有关培养底物[4],人们发现对培养瓶壁进行适当处理可增快贴壁速度。

为提高培养成活率,可加入明胶、%型胶原和&型胶原、Laminin、胎牛血清(FCS),及在制作培养瓶时对玻璃或塑料作特殊处理等不同方法。

由于心肌细胞较一般细胞如内皮细胞体积大、密度高,故培养1h 左右存活的心肌细胞即可贴壁生长,而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死。

培养24h后即可分离出存活的心肌细胞。

由于心肌组织中含有18种细胞,故培养前的细胞纯化很重要,应尽力去除非心肌细胞,尤其是成纤维细胞、白细胞,以免污染心肌细胞,影响其作为一种实验工具。

成年心肌细胞的传代培养至今未能建立起稳定的方法[5],而幼年细胞的传代培养较易。

心肌细胞的质量评定:分离的心肌细胞的鉴定方法很多,有形态学、电生理学、心肌酶学、台盼蓝等,但以形态学和台盼蓝最为常见。

形态学方法质量评估标准为[6]:∋细胞完整,呈杆状,长宽比为4~6 1,肌纤维膜上无空泡;(自律性的细胞所占比例较低,因为心肌细胞的自律性说明心肌细胞有破坏,只有培养的正常心房肌细胞可有低频率(0.02Hz)的舒缩活动;)106首都医科大学学报第21卷在一段时间内(如30min)测定完整的心肌细胞减少率最低。

参 考 文 献1Poper H M ,G er rit I.Isolated adult cardiomyocytes.Raton:CRC Pr ess Inc N.W.Boca,1989.44~802K irby M S,Poole W ilson P A.Impo rtance of cal cium and liyaluronidase concentrations in t he preparation of isolated calcium tolerant myocytes from adult rat and rabbit hearts.J Physiol,1986,373:88~1043M itcheson J S,M ancox J C,Levi A J.Cultured adult cardiac myocytes:F utur e applications,cul tur e methods,mor pho logical and electrophysiolog ical properties.Cardiovasc Res,1998,39(2):280~3004Cheung J Y ,L eaf A,Bonventre.Determinatio n of i solated my ocyte viability.Staining metho ds and functional criteria.Basic R es Cardiol,1985,80(supp1l):23~365Piper H M ,Spahr R ,Pr obst I,et al.Substrates for the attachment of adult cardiac myocytes in culture.Basic Res Cardiol,1985,80(suppl 2):175~1926Lawr ene B,Bug ai sky,Radovan Z.Differentiatio n of adult rat car diac myocy tes in cell culture.Circu Res,1989,64(3):493~500Morphology Study and Isolated and Cultured Method of Adult MyocytesXu Xiufang,Li Wenbin *,Chen Baotian *,L Yanning,Zhao Limin,Chen YanBeij ing H eart L ung and Blood Vessel InstituteAbstract:In order to build m ethod of a stable isolation and culture of adult myocytes,adult rat my ocy tes were isolated with bioenzymes (including 5g/L trypsin and 1g/L colleag ase)perfusing tissue throug h acceding aorta of the heart.Calcium tolerant m yocytes w ere harvested,purifyed and cultured w ith DM EM culture medium.T he myocytes quality was evaluated w ith morphology and trypan blue dye.States of myocytes grow ing in culture w ere observed w ith optical microscope and electron m icro scope photography.Result:Survival rate of aduld rat myocytes w as 91.7%,survival myocytes w ere mo tionlessly attached to the bottom of culture plates,they were intact and rod shaped,their length/w idth ratio w as 4~6:1.Conclusion:The method of isolation and culture of adult rat myocytes was successful.Key words:adult rat myocy tes;trypsin;colleagase;separation technique*Depar tme nt of Heart S urgery of Beij ing A nz he n Hospital,Af filiate o f Cap ital Univer sity of M edical S c iences107第2期许秀芳等:成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察。