超分辨显微成像技术的新发展马利红引言人类获得信息的主要器官是眼睛，然而靠人眼观察客观事物的空间分辨率的极限约为4´米，客观世界中人眼不能分辨的所有细微结构称为微观世界。
显微成像技术将310-微观过程或结构成放大图像，以便于人眼能够直接观察。
研究微观世界所涉及的学科领域十分广泛，有生物、医学、材料科学、精密机械、微电子学、分子及原子物理、核物理等等，微观世界中细分的微量尺度原则上是无穷的，因而显微学是跨多学科的，其发展也是无止境的。
1665年，Robert Hooke用原始显微镜发现了池塘水中单细胞有机体，它的出现为人类打开了微观世界的大门。
光学显微镜由此成为历代生物学家的主要研究工具之一。
生物学家把显微镜作为一种主要工具来研究生物器官、组织和细胞，由此奠定了细胞学和组织学的基础，并对生物学、遗传学、微生物学、病理学和医学的发展起到了极大的推动作用。
但传统光学显微镜有以下两个主要缺点：(1)受衍射极限的限制，其分辨率与照明波长是同一个数量级，具有一个数值孔径(NA=nsin(q))的传统光学显微镜，分辨极限l，称之为瑞利判据；(2)由于使用的是场光源，观测到的是一个宽视野图像，为0.61/NA从而降低了信噪比，影响了图像的清晰度和分辨率。
随着生物医学、材料科学等的发展对显微提出了更高的要求，不仅希望其具有更高的分辨率，而且能对样品进行无损成像，甚至希望可观察其三维图像。
因此，传统的显微镜已不能满足要求。
电子显微镜的分辨率虽然远高于光学显微镜，但它需要在真空条件下工作，因此很难观察活的生物样品，另外电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。
电子显微镜、的局限以及高分辨显微的需求，迫使人们转向超经典衍射极限的光学超分辨理论和技术研究，利用新原理、新技术、新方法来实现光学高分辨力成像和检测。
第一节基于传统的Rayleigh分辨率意义下的超分辨理论光学系统的空间分辨率是一个非常有用的概念，但是关于它的具体定义和描述却有许多不同的见解。
所有的经典分辨率标准都是针对等强度的两个点而言的。
最著名也是最广泛的绝对经典分辩率标准为Rayleigh标准[1]。
按照Rayleigh标准，两个等强度点恰好被分辨的条件是一个点的衍射斑的最大值与另一点的衍射斑的第一零值重合。
因此，Rayleigh标准下的分辩率极限由光学系统的强度点扩散函数的主瓣峰值点到第一零值点的距离所决定。
Rayleigh分辩率标准是以人眼视觉的分辨能力为参考依据的，它还可以推广到光学系统的点扩散函数主瓣附近无零点响应点的情形。
在这种情形下，Rayleigh 标准定义当两点衍射斑合成强度的中央凹陷拥有中心峰值81%强度时两个点扩散函数主瓣峰之间的距离为光学系统的分辨极限。
其它被沿用的分辨率标准包括Buxton[2]标准，Houston[3]标准，以及Schuster4]标准等等。
Buxton标准将合成衍射分布时两主瓣峰值间距与单点衍射半强度恰好相等作为极限标准，Houston标准和Buxton标准类似，但前者基于衍射强度分布，后者基于衍射振幅分布。
Schuster标准定义能分辨的两点之间的距离极限是衍射斑主瓣无重叠，这个标准的分辨率极限是Rayleigh分辨极限的两倍。
上述分辨率标准通常是针对横向分辨率而言的，但对于轴向分辨率同样适用。
它们均与系统点扩散函数主瓣尺度相关，因此只取决于光学系统的数值孔径和工作波长，而与光源强度和探测器灵敏度无关。
这些基于计算图像而言的分辨率标准有很大的缺陷，它们没有将实际的合成光强可能对应多个点源的情况，以及探测图像与照明条件和探测器之间的关系列入考滤范围。
实际上，分辨率问题应该针对探测图像进行讨论，其极限应取决于系统误差和随机误差所导致的探测图像与计算图像之间的差异。
虽然如此，经典分辩率作为一种约定，仍不失为评价成像系统质量的一个重要依据。
光学超分辨成像术涉及到的“超分辨”也是指超越传统的Rayleigh分辨率。
超分辨光学系统就是超衍射极限光学系统，这一直是光学界长期追求的理论目标和现代光学中高新技术研究的方向之一。
其目的是用较小孔径的光学系统实现较大孔径光学系统的功能，达到光学系统成像具有更精细和实现更加精密的探测，对超微细光刻，超微细胞及生物观察，超分辨记录与存储具有决定性的意义。
1952年，Toraldo di Francia[5]把超分辨天线的概念引入光学系统，Toraldo di Francia 提出这样一种理论：光学衍射效应并不是制约光学成像分辨率极限的最后因素。
如果没有噪音，光学分辨率应该是没有上限的。
通常所说的Rayleigh分辨率只不过是一个实际的限制，并不是理论上的极限。
Toraldo di Francia还具体描述了超分辨滤波器的设计方法，首次提出有限视场超分辨的概念。
但当时有限视场超分辨思想并未引起光学工作者的重视，之后超分辨研究仍然基于Rayleigh标准或Sparrow标准。
直到1969年，有限视场超分辨又重新得到重视。
1977年Sheppard[6]首先分析了圆环透镜的旁瓣在共焦系统中被抑制的效应。
从此，有限视场超分辨理论得到了有效的实施，对于有限视场光学超分辨技术的研究开始逐步发展和不断完善。
从研究超分辨理论与实用技术上来看，当前有两条主要研究途径：(1)研究新的成像机理。
对远距离目标提出了综合孔径(synthetic Aperture)这个概念。
所为谓综合孔径就是利用小尺寸的子孔径通过相干合成为一个大孔径系统，其成像分辨率可超过其等效孔径的衍射极限，合成孔径雷达的应用就是一个十分成功的例子。
对近距离成像，激光扫描共焦显微镜(laser scan confocal microscope)的分辨率由聚集的激光束决定，因此，其分辨率比普通的显微镜可提高一倍左右，实际上已具有超分辨能力。
近场光学显微术是探针技术与光学显微技术相结合的产物, 是一种新型超高分辨率显微成像技术。
近年来,近场光学显微术在理论和实践上都取得了突破性的发展。
近场光学显微镜分为近场扫描光学显微镜（SNOM）和光子扫描隧道显微镜（PSTM）。
近年来，其他的超分辨技术也已实现了商业化，包括非线性结构光照明显微术（应用于大视场荧光显微镜中）、利用受激发射损耗显微术(STED)（利用激发态的受激损耗形成荧光分子子显微区域）、多色随机光重构显微术（STORM）(基于光致可控荧光探针)、还有一种基于光激发的荧光蛋白称之为漂白光致局域显微术(PALM).(2)研究恢复物体高频信息的方法。
如何从已知图像或探测信息中尽可能多的去恢复物体高频细节的信息，例如，Gerchberg算法[9]，奇异值分解法，P.D.Santis等则用计算机处理达到超分辨的效果。
本文主要介绍超分辨显微成像的新机理。
光学超分辨成像术是指超越传统的Rayleigh 分辨率。
因此，我们首先阐述一下基于传统的Rayleigh分辨率意义下的超分辨理论。
我们将从两方面论述此理论。
1.基于光学传递函数的超分辨光学理论传统的光学理论早已证明：所有经典光学系统都是一个衍射受限系统，即成像分辩率受衍射极限限制，根据衍射理论，无象差光学系统的理论分辨率是：0 1.22f Dl r = 式中0r 是Airy 圆半径，l 是光源波长，f 是光学系统焦距，D 是光学孔径，此式说明光学系统的分辩率只与波长和相对孔径有关。
七十年代开始Fourier 光学崛起，成像关系发展到频域，即：22()()()2()i vx i vx G v g x e dxg x G v e dv p p p -==òò式中，g(x)是物函数，G(v)是谱函数，u v Rl =，u 是物面坐标，R 是参考球半径。
按Fourier 光学在空间域中，用点扩展函数PSF(u)（point spread function ）来表示系统的成像特性，即像函数是物函数与点扩展函数的卷积：()()*()i u PSF u g u =式中()i u 是像函数，*表示卷积，由于PSF(u)是系统的光瞳函数f(x)的Fourier 变换，即： {}()()PSF u F f x =在频率域中，用传递函数来描述系统的成像特性，其中用相干传递函数CTF(v)来表征相干成像系统，用光学传递函数OTF 来表征非相干成像系统，对任何衍射受限成像系统，其传递函数都是点扩展函数的Fourier 变换，或反过来，点扩展函数是传递函数的逆傅里叶变换，即：{}{}1()()()()()()OTF v F PSF u f x f x PSF u F OTF v *-==Ä=式中，()f x *是光瞳函数的共轭数，Ä表示相关。
上两式说明光学传递函数或点扩展函数都与系统的光瞳有关，由此得到超分辨理论的第一个结论：提高系统的截止频率。
Fourier 光学原理证明成像不仅在空间域进行，而且还在频域进行，利用物体的频谱，通过反复换可获得其成像。
因此，光学系统的物方空间频率越高，则获得的物体的细节越多，分辨率也越高。
然而，光学系统实际上是一个低通滤波器，其截止频率是：c D ft l =式中，l 是光源波长，D f是相对孔径。
此式说明任何一个光学系统的截止频率取决于它的光瞳尺寸。
合成孔径的分辨成像就是例子。
超分辨光学理论的第二个结论是：改变光瞳的形状与参数， 提高系统的点扩展函数，就可以实现系统的超分辨。
光栅显微镜的分辨成像就是例子。
更浅显的方法示于图1和图2。
图1是用中心遮拦实现超分辨的例子。
图2是用斜照明实现超分辨的例子。
图1中(a)表示当光学孔径为2a 时，按式(1)其衍射分布为图1(b)中的实线所示，Airy 斑直径为02r ，当此孔径加一圆形同心遮拦，其孔径为2(1)a n n >,则其衍射分布将扩大1n ，中心光强将降低21n，如图中虚线所示，二衍射分布的叠加结果是实线与虚线的相交点p 、q ，其光强近于0，这时的Airy 斑直径02pq b r <，因而获得超分辨的结果。
图2是用斜照明方法获得超分辨的原理图。
当光瞳函数在横向左右改变e ±，按Fourier 分析，则有：()()2()cos g x g x G v v e e e -++ƒ从而获得图2所示的频谱分布图，显然，斜照明的02pq r r <，光栅显微镜是斜照明超分辨的具体应用。
图1 中心遮拦实现超分辨 图2斜照明实现超分辨2.基于光学系统信息能力不变性的超分辨理论 W.Lukosz 运用信息理论,得出了一个有关光学系统极限分辨率的定理。
该定理指出,对于一个给定的光学系统,并不是所传输的空间频率的带宽不变,而是其所传输的光学信息的自由度数保持不变,用公式表达为:2(1)(1)(1)x x y y T NF L B L B TB =+++式中NF 是光学系统可以传输的波场的自由度数目，它定义为物方面积与光学系统的通带宽度之积的两倍，再乘以时间自由度数，因子2是考虑了存在两个独立的极化状态；Bx 和By 分别是x 和y 方向的空间频率带宽； Lx 和Ly 则分别是x,y 方面的视场；BT 是光学系统的时间频带宽度；T 是观察时间。