• 不耐热液体：过滤除菌；
• 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
灭菌方式的选择
项目 玻璃器皿 金属制品 带螺口盖的玻璃品 玻璃移液管 枪头 消毒方式 干热 干热 高压灭菌，将盖悬 松 干热 高压灭菌 高压灭菌 琼脂 蛋白胨 EDTA 甘油 过滤 氨基酸 抗生素 牛血清白蛋白 胶原酶
HEPES 甲基纤维素
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。
• 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
明确地选择出来，就成为一个细胞株。
细胞培养基本概念
• 有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后 就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这 种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞 系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生， 也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力 后，就成为连续细胞系。 • 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一 定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、 维生素、矿物质 )、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其 物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。
湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要直立放
臵）； • 自然冷却后臵于烘箱中烘干。
水的制备和灭菌
• 细胞培养需要用超纯水（UPW）； • 第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶 体（总有机碳TOC ≤10ug/L）；第三：去离子（电阻 ≥10MΩ/cm）； • 高压灭菌121℃，20min，自然冷却。
配置完全培养基
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水，臵于磁力搅拌器上，设定200r/min，边搅 拌边加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠）； • 用注射器吸取超纯水，将包装袋内残留培养基洗下； • 干粉溶解后加入2.438g NaHCO3，搅拌至完全溶解； • 用HCl和NaOH调节PH为7.2，过滤除菌后（PH接近7.4）4℃保存； • 商业胎牛血清一般是热灭活的，可以直接使用，如果需要过滤，先用 0.22μm滤器过滤后，再用 0.1μm滤器低压过滤才能保证无菌、无支 原体。 • 双抗：称取氨苄青霉素 0.625g ，链霉素 1g ， PBS 定容至 100ml ， 4℃过 夜，过滤除菌分装。 • 使用时如需配臵 200ml 完全培养基，需加入 180ml DMEM/F12 ，加入 20ml胎牛血清 ，再加入2ml双抗即可。 • 使用时再加入血清的好处是DMEM/F12培养基可以4℃保存6~9个月，而 加入血清后只能保存2~3周。
PBS的制备
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水； • 放在磁力搅拌器上，设定转速200r/min； • 打开PBS干粉（1L装）加入烧杯中； • 搅拌至完全溶解； • PH计检测PH为7.4，变化＜0.1； • 分装至灭菌的储液瓶中，盖子只轻旋一圈，放入灭菌锅中湿热灭菌；
• 自然容器或无菌吸管的上方往来。
• 倒出液体：任何时候都不要从试剂瓶或培养瓶中直接倾倒培养 基和试剂。
小结
• 保持一个干净有调理的工作空间，并仅在需要的时候才在 其中工作。 • 尽可能的预先准备好再开始操作，使培养物在培养箱外停 留最短的时间，而且要做到各种操作快速、简便和顺利。 • 保持能看到操作面上的每样东西，时时警惕无菌面和非无
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放臵在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。 • 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要
也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质，
还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响 HEPA过滤的寿命。 • 试剂瓶和培养瓶的操作：在洁净台内可以使试剂瓶口敞开直立，
•
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌： 160 ℃， 1h； • 热稳定的液体：水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品：硅 树脂、尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯用湿热灭菌： 121 ℃， 20min；
• 使用前24~48h，放入干热灭菌箱中，160℃灭菌1h，自然冷却后
使用； • 100目和600目的筛网需要超声清洗。
塑料制品的清洗和灭菌
• 将塑料制品放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（Decon）的 洗液中浸泡30min，自来水冲洗干净； • 臵于超声清洗器中清洗30min； • 用自来水充分清洗后用去离子水清洗（塑料制品要用专用的刷 子或者将自来水连上胶管伸进塑料管内部冲洗）； • 将离心管的盖子和管体分开用图纸包起来，直立放入灭菌锅中
酵母：培养物被酵母污染后 也会变得浑浊， 但pH 值变化 极小，污染严重时 pH 值才会 升高。在显微镜下，酵母呈 单个卵圆形或球形颗粒，有 些会芽生出较小的颗粒。图 为293细胞被酵母污染。
霉菌：是真菌界的一种真核微生物，以被称为菌丝的多细胞丝状体形式生长。 在显微镜下，菌丝体通常呈细束状纤维，有时呈较为密集的孢子团块。 病毒：是一种微观感染性物质，利用宿主细胞结构进行复制。病毒体积极小， 因而要检测培养物中有无病毒以及将其从细胞培养实验室所用试剂中去除都 十分困难。使用病毒感染的细胞培养物时却会对实验室工作人员造成严重的 健康威胁，特别是当实验室培养的是人或灵长类动物细胞时。
菌面的偶然接触。
• 实验完毕后，保持工作区的干净整洁。
污染
• 化学污染：培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂 和去污剂； • 生物污染：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细 胞系的交叉污染。
细菌：通常被细菌污染的培养物呈云雾状 (即：浑浊状)，有时表面会覆盖一层 薄膜。另外，经常还会发现培养基的 pH 值突然降低。在低倍显微镜下可见， 细菌为细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察可以分辨出各个细菌的 形状，有球状、杆状和螺旋状等。图为被大肠杆菌污染的293细胞
• 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2环
境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• • 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各种 试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养实验室
隔间 走廊
二更 一间 二间 三间
一更 准备室
细胞培养设备
• 基本设备： • 细胞培养通风橱 (即：层 流通风橱或生物安全柜) • 培养箱 (推荐使用湿式二 氧化碳培养箱) • 水浴锅 • 离心机 • 冰箱和冰柜 (–20°C) • 细胞计数器 (例如： Countess® 自动细胞计数 器或血球计数器) • 倒置显微镜 • 液氮 (N2) 冷冻柜或冻存 容器 • 灭菌器 (即：高压灭菌器) • 扩增设备： • 抽吸泵 (蠕动泵或真空泵) • pH 计 • 共聚焦显微镜 • 流式细胞仪 其他用品： • 细胞培养容器 (例如：培 养瓶、培养皿、滚瓶、 多孔板) • 吸管和移液器 • 注射器和针头 • 废物容器 • 培养基、血清和试剂 • 细胞系
流）； 随时移走不再需要的物品； 要在视野范围内操作； 如有任何溢出物需随时擦去，并用70%乙醇擦洗； 实验完毕要移走洁净台里的所有物品（什么都没有） ，并用70%乙醇彻底擦洗工 作面，然后紫外灭菌30min；
• • • • •
在通风橱中部开阔区域放臵细胞培养容器 移液器臵于右前方易于取用的地方 试剂和培养基臵于右后方，便于吸取 试管架臵于中后部，用于固定其他试剂 小型容器臵于左后部，用于盛放废液
细胞培养基本知识
细胞培养基本概念
• 细胞培养：从动物或植物中取出细胞，使其在合适的人工环境中生长。
• 细胞来源：细胞可直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，
也可来自已经建立的细胞系或细胞株。 • 原代培养：是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖， 直到占据所有可用基质(即：汇合) 的培养阶段。 • 传代培养：在细胞生长至汇合，必须将细胞转移到新的容器中并更换
• 自己配臵的所有试剂、培养基和溶液必须采用适当的灭菌方法
(例如：高压蒸汽、无菌过滤) 进行灭菌。 • 引进的培养物（如购买的细胞系）是高危污染源，要先经过检 疫，并坚持用不含抗生素的培养基培养直至证明没有污染。
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。 • 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。
•
移液：使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体；每支吸
管只能使用一次，以免交叉污染。使用时方可打开无菌吸管的包装。吸 管应始终位于工作区域内。
•
一般移液操作用移液管和电动移液器，微量移液操作（1ml及以下）用移
液器，一次为多个器皿分装液体用注射器，只有灭菌的部分（移液管、 枪头、 注射器）可以伸进无菌容器内（储液瓶、细胞培养瓶），移液时 避免使吸管尖端触碰到任何非灭菌物品包括瓶口螺纹的外缘。
酚红 盐溶液 水
药物 谷氨酸盐
生长因子 HCL NaHCO3 NaOH 血清 丙酮酸钠 胰蛋白酶
离心管(5ml，15ml， 高压灭菌，直立放 50ml) 置 EP管(1.5ml，2ml， 5ml，10ml) 试管 高压灭菌 干热
艾本德移液器（新） 高压灭菌，整支