儿童肺炎支原体感染及耐药检测与分析? 儿童肺炎支原体感染及耐药检测与分析* ·论著· 儿童肺炎支原体感染及耐药检测与分析* 刘调侠1 张晓瓒2 李延琴1 (铜川市妇幼保健院1.儿科；2.检验科，陕西铜川727007) 【摘要】目的分析肺炎患儿中肺炎支原体(MP)的感染及耐药情况，并探讨其临床特点及基因分型特征，为临床合理选择抗生素提供理论依据。
方法收集2015年1月至2015年12月铜川市妇幼保健院儿科以发热、咳嗽等呼吸道症状首诊确定MP感染的住院患儿120例。
通过肺炎支原体抗体检测、体外培养及核酸检测了解肺炎支原体感染状况，测定多种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC值),分离出耐药菌株。
根据药敏试验鉴定结果分为耐药组(n=98)和非耐药组(n=22)，比较耐药组与非耐药组患儿临床特征；将耐药组98例患儿依据初选抗生素种类分为初选阿奇霉素或红霉素组(n=78)和初选头孢或青霉素类(n=20)，比较两组患儿的临床特点。
将耐药菌株的23SrRNA基因序列与标准珠相比对，研究耐药菌株的23SrRNA基因突变位点。
结果120例经临床诊断为MP肺炎的患儿中，98例体外药敏试验结果提示为耐药支原体肺炎，对大环内酯类药物高度耐药。
耐药组发热时间、住院时间及给予大环内酯类药物(阿奇霉素)后发热时间均较非耐药组长(PP>0.05)。
耐药组与非耐药组之间预后比较差异有统计学意义(PP 【关键词】肺炎支原体；感染；儿童；耐药机制肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)是患儿急性上、下呼吸道感染的常见病原体之一。
研究表明，肺炎支原体肺炎具有年龄分布特征和季节性，不同国家和地区的发病率差别较大。
儿童MP感染主要以大环内酯类药物治疗为主；近年来关于MP耐药现象的报道较多[1]。
本研究通过对铜川地区住院肺炎患儿肺炎支原体感染及耐药检测与分析，以期对临床MP肺炎的诊治提供依据。
1 资料与方法1.1 一般资料收集本院2015年1月至2015年12月以发热、咳嗽等呼吸道症状首诊确定MP感染的住院患儿120例，其中男性患儿64例(53.33%)，女性患儿56例(46.67%)。
MP肺炎诊断标准依据《诸福棠实用儿科学》第7版诊断标准，有发热、持续剧烈咳嗽、肺部啰音等呼吸道症状及体征，伴胸部影像学单侧或双侧异常改变，酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺炎支原体抗原阳性，青霉素或头孢类抗生素治疗无效，病程初期未发现其他病原感染的证据。
排除标准：①体液和细胞免疫异常。
②正在接受免疫抑制剂治疗。
③既往患支气管哮喘、反复呼吸道感染、先天性或继发性免疫抑制或缺陷、肾脏或肝脏疾病、心血管疾病及结缔组织疾病等，既往1个月内接受住院治疗。
④既往有重症肺炎病史仍未痊愈。
⑤病历资料不完整。
纳入本研究的病例均已获患儿家属知情同意。
依据是否耐药分为耐药组(n=98)和非耐药组(n=22)；依据98例耐药支原体肺炎按初选抗生素种类分为初选阿奇霉素或红霉素组(n=78)及初选头孢或青霉素类抗生素组(n=20)。
1.2 方法1.2.1 主要仪器及试剂TGL-16G型台式高速离心机、Bio-rad公司Opticon 2 PCR扩增仪、GeneAmp PCR System9600、HB-100型电热恒温水槽、ELX-800酶标仪、Milli-Q纯水系统、DNP-9052型电热恒温培养箱、PCR扩增试剂、MP-IgM检测试剂盒、DNA提取试剂盒、MP快速液体培养基、MP标准株MP-129。
1.2.2 标本采集所有患儿在入院后24 h内完成标本的采集,抽取外周血2 ml用于ELISA法检MP-IgM抗体，用无菌生理盐水浸湿的无菌咽拭子适度用力刮拭患儿咽后壁,标记后行MP培养和MP-PCR 检测。
1.2.3 检测方法①酶联免疫吸附法试验(ELISA)检测MP-IgM抗体:按照深圳博卡生物有限公司提供的试剂盒说明书进行操作及结果的判定。
②MP快速液体培养法：液体培养基在使用前置于4 ℃保存,用时移至室温待培养基融化后使用。
应注意MP对热和干燥敏感,取材后应立即接种,若置于转运培养基中,4 ℃能保存72 h。
所有患儿采取标本前用温水漱口,然后用无菌生理盐水浸湿的咽拭子在患儿口腔咽后壁捻转数次,60 min内送至实验室,小心取出棉拭子,置于含培养基的小瓶中,揽动棉拭子数次,再把棉拭子对着瓶壁,尽量挤压出其中液体,取出棉拭子弃至医疗垃圾桶中。
盖上瓶塞,置37 ℃恒温箱中培养24～48 h即可观察结果，待培养基颜色由红转黄且无明显沉淀物时，判断为肺炎支原体培养阳性。
利用九种抗生素的高低浓度在体外对微生物生长的抑制作用,对微生物作耐药性进行分析,采用珠海市银科医学工程股份有限公司生产的MP 培养药敏试剂盒，严格按说明书进行操作。
③肺炎支原体PCR检测：向咽拭子中加入4倍体积的生理盐水，用1 ml移液器反复吹打后置4 ℃冰箱。
用移液器混匀后吸取1～1.5 ml离心管中。
12 000 rpm离心5 min 后弃上清；在沉淀中加入50 μL的DNA提取液充分混均。
100 ℃恒温处理10 min;12 000 rpm离心5min后保存于-20 ℃冰箱中备用。
2×缓冲液10.0 μL，10.0 μmol/L 的引物P3 1.0 μL，10.0 μmol/L 引物P4 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。
反应条件及循环：93 ℃变性2 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；75 ℃延伸5 min。
荧光测定PCR产物采用胶回收试剂盒回收，采用T Easy载体连接体系克隆，4 ℃连接过夜。
转化感受态细胞，蓝白斑筛选。
采用Blast功能进行序列分析，挑选测序结果一致的克隆提取质粒备用。
巢式PCR：2×缓冲液10.0 μL，40×Assay Mix(含P3，P4，T3和T4各0.5 μL)，DNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，总体积20.0 μL。
反应条件及循环：95 ℃ 1 min，92 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，40个循环。
收集扩增前，扩增时，扩增后荧光信号，采用SDS 软件获得标准曲线。
④肺炎支原体核糖体23s全序列分析：利用外引物MN23SDVF、MN23SDVR和巢式引物MN23SF1812、MN23SR2152进行扩增,PCR产物采用双向测序。
测得序列与NCBI已登录的MP标准珠MP129 23SrRNA基因相比对。
产物由华大基因科技有限公司进行测序。
采用DNAstar软件与肺炎支原体M129(GenBank Accession No．X68422)进行序列比对分析。
1.3 观察指标1.3.1 记录患儿的一般临床资料性别、年龄、住院天数、发热时间、呼吸道症状持续时间、初起选择抗生素的种类、病程中更换为大环内酯类抗生素的时间，使用大环内酯类抗生素后发热时间、大环内酯类抗生素的使用时间等。
1.3.2 记录相关辅助检查结果白细胞总数、中性粒细胞比例、C反应蛋白、血沉、肺炎支原体抗体结果、咽拭子肺炎支原体PCR结果、肺炎支原体培养结果及MIC值等，胸部影像学表现及影像学指标好转时间。
1.3.3 疗效判断疗效分痊愈，显效，进步，无效4级。
痊愈:初始治疗2周内体温、呼吸道症状及体征正常,实验室检查血象、CRP均恢复正常;显效:体温呈下降趋势,但呼吸道症状、体征，实验室检查均未完全恢复正常;进步:体温不退,但呼吸道症状、体征、实验室检查中至少有一项改善;无效:体温不降,呼吸道症状体征、实验室检查无改善,或一度改善又恶化。
1.4 统计学方法应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。
计数资料采用2检验，计量资料用t检验，组间比较采用独立样本t检验，非正态分布资料采用非参数检验。
P 2 结果2.1 一般资料120例经临床诊断为MP肺炎的患儿中，血清MP-IgM抗体检测均为阳性。
113例咽拭子肺炎支原体PCR 检测阳性；其余7例PCR检测阴性，PCR检测阴性者咽分泌物支原体培养阳性。
咽分泌物支原体培养阳性者为101例。
98例体外药敏试验结果提示为耐药支原体肺炎，对大环内酯类药物高度耐药。
体外药敏实验结果见表1。
表1 120例MP肺炎患儿感染样本的药敏试验结果(MIC值，mg/L)Table 1 Drug sensitivity test in children with MP pneumonia samples菌株红霉素阿奇霉素克拉霉素四环素左氧氟沙星环丙沙星加替沙星莫西沙星米诺环素耐药株64～25616～25664～2560.125～0.50.25～0.50.5～1.00.032～0.0640.016～0.0640.0125～0.5非耐药株0.0040.0040.0040.250.250.50.0320.0320.06 2.2 MP肺炎耐药组与非耐药组临床特点比较两组患儿的临床表现及检验结果显示，耐药组发热时间、住院时间及给予大环内酯类药物(阿奇霉素)后发热时间均较非耐药组长(PP>0.05)，见表2。
2.3 初选阿奇霉素或红霉素组和初选头孢或青霉素类抗生素组临床特点比较初选头孢或青霉素类抗生素组20例，治疗中更改为大环内酯类抗生素药物的平均时间为病程第(5.2±1.8) d。
两组比较后发现在呼吸道症状持续时间、使用大环内酯类抗生素后发热时间、白细胞计数等指标差异有统计学意义(P 表2 支原体肺炎耐药组与非耐药组临床特点比较±s) Table 2 Clinical features of resistant group andnon-resistant group 临床指标耐药组(n=98)非耐药组(n=22)P年龄(岁)8±37±40.518发热时间(d)11±48±50.007呼吸道症状时间(d)18±516±40.085WBC(×109/L)7±48±40.176中性粒细胞比例0.68±0.740.61±0.830.457CRP(mg/L)11.01±18.2313.0±20 .610.972ESR(mm/h)25±1322±140.682胸部影像所见好转时间(d)14±313±50.661住院时间(d)12±38±40.001ML总疗程10±39±50.438用ML后发热时间(d)8±36±40.042 2.4 耐药组与非耐药组患儿预后比较耐药组与非耐药组之间预后的比较有统计学意义(PP 表3 初选不同抗生素治疗的耐药支原体肺炎患儿的临床特点±s) Table 3 Clinical characteristics of children with different antibiotics resistance of mycoplasma pneumonia primaries 临床指标初选抗生素为阿奇霉素或红霉素(n=78)初选抗生素为青霉素类或头孢类(n=20)P年龄(岁)8±28±50.237发热时间(d)10±611±60.681呼吸道症状时间(d)19±517±40.046WBC(×109/L)6±411±60.000中性粒细胞比例0.65±0.750.71±0.810.262CRP(mg/L)10.98±16.2311.51±2 0.610.074ESR(mm/h)26±1323±140.922胸部影像所见好转时间(d)14±314±40.939住院时间(d)13±311±40.159ML总疗程10±310±50.249用ML后发热时间(d)9±35±40.009 表4 耐药组与非耐药组患儿预后比较Table 4 prognosis of resistance group and non-resistant group 预后耐药组(n=98)非耐药组(n=22)P痊愈30(30.61)14(63.64)①0.027显效39(39.79)6(27.28)进步20(20.41)1(4.54)无效9(9.19)1(4.54) 注：与耐药组比较，P 2.5 肺炎支原体核糖体23S rRNA全序列分析约90%耐药MP株发生了2063位A→G(A2063G)的突变，少数MP耐药株发生了A2064G(约5%)、A2063C、C2617G/A 的突变，而且A2063G/C和A2064G 的突变能引起MP 对红霉素产生高水平耐药，并对其他大环内酯类发生交叉耐药。