农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
SPE条件的优化
图4 脂溶性维生素用不同比例的乙醇和水的溶液溶解后在小柱上的保留能力
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
SPE条件的优化
表2 脂溶性维生素用不同有机溶剂溶解后在小柱上的保留能力
溶剂 乙腈
浓度 （%）
45
保留能力 （%）
K3
A-ac
UV：265、230 nm
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
2.52
5.2 6
13.18
17.30
20.7 0
图2 脂溶性维生素的分离色8谱.图57（流动相为乙腈:水 ＝ 98:2）
2.59
5.14
10.50
14.0 4
图3 脂溶性维生素的分离色谱图（流动相为甲醇:水 ＝ 98:2）
农业部饲料工业中心M A F I C
实现操作简便、准确、快速、对环境污染小等特点
农业部饲料工业中心M A F I C
技术路线
色谱条件的 摸索
样品前处理 方法
验证试验
农业部饲料工业中心M A F I C
柱子的选择 流动相的确定 检测器，检测波长 流速，柱温，进样体积
酶解法 固相萃取法
线性 准确性和精确性
检测限
试验研究
农业部饲料工业中心M A F I C
费时，操作复杂，结果变异大 大量有机溶剂的使用 单一或脂溶性维生素A、D、E的同步分析 ➢ 新方法的研究
农业部饲料工业中心M A F I C
研究背景
立题依据--商品形式
➢ 维生素A
维生素A醇、维生素A棕榈酸酯、维生素A乙酸酯
➢ 维生素D3
维生素D3粉剂
➢ 维生素E
D (L)--生育酚、D (L)--生育酚乙酸酯
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
主要试剂
维生素A-ac、E-ac、E、D3、K3标准品 Savinase酶 色谱甲醇、无水乙醇 超纯水 0.2%氨水溶液 5%甲醇溶液
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
色谱条件
色谱柱：Atlantis dC18柱 流动相：甲醇/水 = 98/2，v/v 流速: 1 mL/min 检测器：UV，265 nm ：K3、A-ac、D3
5000 rpm 离心10 min
试验研究
净化方法
步骤
表1 固相萃取过程及作用 操作
作用
活化/平衡
1 mL甲醇/1 mL水
活化小柱
上样 淋洗 洗脱
吹至近干的提取液加入65%乙醇溶液
分析物在 柱上保留
1 mL 5%甲醇溶液
去除杂质
1 mL无水乙醇
洗脱脂溶 性维生素
农业部饲料工业中心M A F I C
101.10
4.3
2.40
2.329 0.068
97.05
2.9
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
最低检测限
维生素 K3 A-ac D3 E E-ac
检出限（g/mL） 定量限（mg/kg）
0.075
2.5
0.06
2.0
0.06
2.0
1.20
40.0
1.26
42.0
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
色谱条件的优化
柱温：30、35℃ 流速：0.6 、0.8 、 1.0 mL/min 流动相：50:50、60:40、80:20、85:15、90:10、
92:8、95:5、98:2、99:1，v/v 检测波长：PAD：200-400 nm
94.60
4.8
1.00
0.876 0.076
87.64
8.6
A-ac
0.10
0.092 0.007
91.66
7.8
0.40
0.427 0.004
106.66
1.0
2.00
1.788 0.149
89.41
8.4
D3
0.02
0.021 0.002
104.64
7.5
0.24
0.234 0.005
D3
E
51.3
100.0
100.0
100.0
乙醇 甲醇
55
29.2
100.0
100.0
100.0
65
21.3
100.0
100.0
100.0
45
97.7
100.0
100.0
94.2
55
100.0
100.0
100.0
100.0
65
0
45
100.0
92.6
47.7
30.5
230 nm：E、E-ac 柱温：35℃ 进样体积：10 L
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
样品前处理
样品和碱性蛋白酶 10 mL0.2%氨水
40-50℃水浴 65 mL 40-50℃水浴 超声 20-30 min 乙醇 超声 20-30 min
乙醇 定容
上清液待用
农业部饲料工业中心M A F I C
➢ 维生素K3
NaHSO3甲萘醌、NaHSO3甲萘醌复合物
农业部饲料工业中心M A F I C
研究背景
O
CH3 SO3H
O
立题依据--原理
O
NH2
N
O
CH3
SO3Na
O
农业部饲料工业中心M A F I C
O
CH3
O
研究目的
通过高效液相色谱法，建立同步检测饲料中脂溶性维 生素K3、A-ac、D3、E、E-ac的方法
R2=0.9999
R2=1
图6 脂溶性维生素的线性图
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
表3 饲料中脂溶性维生素的添加回收率（n = 5）
维生素
添加水平 （mg/g）
实测值 （mg/g）
回收率 （%）
C. V. （%）
K3
0.01
0.013 0.001
129.60
8.8
0.10
0.095 0.005
试验研究
365
254 265 292 290
图1 在PAD200-400 nm波长下的脂溶性维生素光谱图
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
样品前处理条件的优化
氨水的浓度：0.02%、0.1%、0.2% 超声提取的时间：10 、30 、60 min 超声提取的温度：40-50℃ 氨水与乙醇的比例: 10 : 90；15 : 85；20 : 80
丙酮、氯仿、乙醇、甲醇 洗脱剂的用量： 1 、2 、3 mL
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
图5 添加脂溶性维生素标样的浓缩料样品处理液 过SPE小柱前（A）和过小柱后（B）的色谱图
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
R2=1
R2=0.9999 R2=1
97.66
2.0
1.80
1.756 0.065
97.53
3.7
E
0.08
0.079 0.004
99.33
4.9
0.40
0.403 0.013
100.74
3.3
1.60
1.662 0.048
103.88
2.9
E-ac
0.08
0.079 0.006
99.31
7.9
0.80
0.809 0.035
试验研究
主要仪器
LC-10A高效液相色谱仪（日本，岛津 SHIMADZU）包 括：脱气泵（DGU-12A）、输液泵（LC-10AT）、系 统控制器（CBM-10A）、自动进样器（SIL-10A）、柱 温箱（CTO-10A）、紫外-可见光检测器（SPD-10A）、 数据站（CLASS LC10）
Waters高效液相色谱仪：Alliance 2690，2487紫外检测 器，Masslynx软件数据系统
结论
采用高效液相色谱和固相萃取技术实现了饲料中脂溶 性维生素K3、A-ac、D3、E、E-ac的同步检测
16 min内完成脂溶性维生素的分离，回收率均在 87%-130%
农业部饲料工业中心M A F I C
农业部饲料工业中心M A F I C
高效液相色谱法同步测定 饲料中脂溶性维生素
报告人：贺 平 丽 中国农业大学农业部饲料工业中心
2007年8月21日
农业部饲料工业中心M A F I C
内容
➢研究背景 ➢研究目的 ➢技术路线 ➢试验研究 ➢结论
农业部饲料工业中心M A F I C
研究背景
➢ 脂溶性维生素简介 ➢ 研究现状
常用的脂溶性维生素分析技术 ➢ 目前主要存在的问题
55
100.0
100.0
98.6
68.5
65
100.0
100.0
100.0
100.0
E-ac
100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 80.5 87.9 100.0
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
SPE条件的优化
淋洗液：水、5%的甲醇溶液 洗脱剂的种类：四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯、