血细胞分离培养以前认为红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等血细胞都属终末分化细胞, 很难在体外培养生长或仅能短期培养而不能传代, 近年来由于细胞培养技术的发展, 已有血细胞培养成功的报道, 正常血细胞在体外培养生长时间短, 只有白血病细胞, 血友病细胞、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系, 但多半为EB 病毒等致瘤病毒引起的转化细胞, （EBNA检查阳性）, 二甲基亚砜（DMSO ）处理也可诱导这些细胞分化发生逆转, 表现为正常细胞. 所建立的细胞系多半为单核细胞系、B 淋巴细胞系、T 淋巴细胞系, 只在IL-2 产品问世后,T 细胞才可在体外建系、建株.血细胞可从外周血中用梯度液通过离心分层后分离获得. 也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞, 从腹腔刺激后的冲洗液中可获得大量的单核- 巨噬细胞, 从骨髓中可以获得前提血细胞, 并可长期培养生长. 加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖, 例如在淋巴细胞中加入IL-2 （TCGF ）, 可促进T 细胞生长, 建立T 淋巴细胞系. 在多发性骨髓瘤细胞（B 细胞）培养中, 加 B 细胞生长因子, 可建立 B 细胞系；加入IL-6 （或正常淋巴细胞培养48h 的培养上清中的IL6 ）可使 B 细胞在体外长期培养, 建立了IL-6 依赖的B9 细胞系. 在骨髓单个核细胞培养中加入二羟基维生素D3, 可使单个核细胞分化为成骨细胞及破骨细胞.（一）外周血细胞分离：外周血中除红细胞外, 还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等, 通常是分离这些血细胞的重要来源. 其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll 分离法.1 、自然沉降法：将无菌抗凝血放入试管中, 在37 ℃水浴中静置, 自然沉降1-2h, 可见到红细胞下沉, 并有明显分层, 上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞, 下层主要为红细胞. 此方法简便但各层中的细胞种类多, 不纯. 血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主, 但也含有血小板, 大单核细胞和少量红细胞. 下层虽以红细胞为主, 但也有上述各种细胞, 此法适用于淋巴细胞转化试验.2 、差异沉降法：用6% 的右旋糖酐或3% 的明胶溶液无菌消毒后, 分装于中试管中, 由于这些物质能使红细胞形成“串状”, 比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快, 因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开. 其方法如下：用6% 的右旋糖酐溶液5-10ml, 经抗凝血5ml 加入上层中混合后静置于37 ℃水浴中30-60min, 即可见红细胞下沉, 上层富含大量粒细胞和淋巴细胞, 下层为红细胞, 使两者易于分离开, 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验, 下层可用于红细胞培养和实验, 经PBS 洗 3 次后即可加入培养基培养, 可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产. 此法分离的细胞纯度也不高.3 、氯化铵分离法：0.83% 氯化铵（NH4CL ）可使红细胞破裂, 通常将分离获得的粒细胞. 淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83% 氯化铵进行裂解, 以排除红细胞的干扰. 另外, 此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备, 在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用. 方法如下：将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min 离心20min, 吸出上清血浆, 将下层的红细胞、白细胞混合后, 加入0.83 氯化铵, 用量为血细胞悬液液量的 3 倍, 于 4 ℃作用20min 后离心弃去上清.在沉淀层中再加入新鲜0.83 氯化铵混匀后于 4 ℃作用20min, 以便彻底清除红细胞, 离心弃上清.收货下层的细胞用PBS 洗3 次后, 再用含5% 人AB 型血清的（含100U/ml 卡拉霉素）培养基制成悬液, 调整细胞浓度为（8-10 ）x10^9 个/L, 分瓶加塞在37 ℃普通培养箱中旋转培养（12r/h ）.混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F ）诱导22h, 收货上清就可生产白细胞干扰素. 此法分离的细胞纯度更差.4 、Ficoll 分离法：采用Ficoll 和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液, 通过2000r/min 离心后可使血细胞以不同相对密度分离开, 如分离淋巴细胞可选用相对密度1.077 的分离液；若分离血小板可用相对密度 1.090 的分离液, 若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度 1.120 的分离液, 现以淋巴细胞分离为例, 方法如下.取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液, 用无钙、镁离子的PBS 稀释3-4 倍.将Ficoll 淋巴细胞分离液事先分装于离心管中, 使其沉于管底, 并在37 ℃中预热.用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入, 不让细胞悬液冲破分层液界面, 使其悬于分层液上方.以2000r/min 离心20min 后, 不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上, 由于红细胞在Ficoll 作用下成串下沉, 故在离心管中分布在Ficoll 层下方, 淋巴细胞分布在Ficoll 层上方.收集浑浊带分离获得的淋巴细胞, 用无钙、镁离子的PBS 洗3 次后, 再用培养基洗1 次后计数, 分瓶培养.此法分离获得淋巴细胞纯度高.分离液的制备：9% Ficoll （20 ℃下相对密度约1.020 ）24 份与33.4% 泛影葡胺（用泛影钠或Conray400 也可, 在20 ℃下相对密度约1.200 ）10 份混合后, 将其相对密度调至 1.077 金额可获得淋巴细胞分离液, 于121 ℃高压蒸汽灭菌30min, 室温保存备用. 若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整, 若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll 来调整.（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液, 在免疫学研究中是经常用到的. 方法如下.无菌取上述淋巴器官, 若为扁桃体, 应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后, 在含高浓度抗生素的洗液中 4 ℃浸泡2-4h, 以防污染.将淋巴器官剪成碎块, 用镊子压挤碎块, 或在金属丝网上研磨, 用洗液冲洗, 或用玻璃匀浆器研磨, 制成悬液.自然下沉10min 后, 吸取上层细胞悬液, 弃去下层沉淀的组织块,1500r/min 离心, 取沉淀物, 用无钙、镁离子的PBS 洗 2 次后, 混悬于培养基中, 分瓶培养.用上述分离法所获得的拎包细胞, 可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验, 同时可用于细胞因子的诱生和制备, 或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK 细胞) 、T δ细胞等, 供细胞移植用.（三）人脐带血细胞分离培养：人脐带血来源方便, 采集容易, 对母婴均无伤害. 近年来研究表明, 脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质, 具有刺激和促进骨髓造血干/ 祖细胞增殖、分化和再植能力的功能, 是造血生长因子的重要来源.脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞, 其中CFU-G 、BFU-E 、CFU-GM 近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/ 祖细胞, 比骨髓更原始, 具有很强的自我复制和再植能力. 脐带血中还含有类似于骨髓的基质细胞, 对骨髓造血具有支持作用, 在体外培养扩增中具有更大的增值能力, 是造血干细胞的理想来源, 已被应用于Fanconi 贫血、某些白血病和恶性肿瘤的治疗, 并容易获得骨髓造血功能的重建.随着脐带血造血功能研究的不断深入, 为体外培养和扩增脐带血干/ 祖细胞建立了切实可行的方法.健康产妇于新生儿娩出后立即断脐, 用含抗凝剂的采血装置无菌采集正常足月顺产儿脐带血, 一般可采集50-80ml.将脐带血用无钙、镁离子的PBS 稀释2-3 倍, 缓慢沿壁轻轻加入含Ficoll-Hypque 淋巴细胞分离液的离心管中, 注意加样时切勿冲破分层界面,2500r/min 离心25min.收集单核- 淋巴细胞层细胞, 先用PBS 洗2 遍, 再用培养基洗 1 次, 活细胞计数, 存活率应大于90% 以上.将分离获得的脐带血单个核细胞（MNC ）, 浓度109 个/L, 用含5%AB 型血清（或10% 脐带血）的RPMI1640 培养基, 外加10mg/ml 干细胞因子（SCF ）、10ng/mlIL-6 和IL-3 、2U/mlEPO 、10ng/ml 的G-CSF 和GM-CSF, 置于37 ℃、5%CO2 下进行培养.每周半量换液一次, 共培养 5 周.10 天左右可传代培养, 不断使脐带血中的单个核下拨进行扩增, 培养 5 周, 可使单个核细胞数增加252 倍, 同时了检测造血干细胞中CD34+ 细胞的比例, 经检测,CD34+ 细胞增加250 倍. 一般脐带血中MNC 体外扩增 2 周即可满足一个成人造血干细胞移植的需求.若在分离获得的脐带血单个核细胞中, 用含20% 小牛血清的ROMI1640 培养基外加二羟基维生素D3 、地塞米松、维生素C 等刺激物, 培养1-2 周后, 可见有贴壁基质细胞的生长形态（呈梭形、多角形）, 说明脐带血中基质细胞可支持造血干细胞生长. （四）巨噬细胞分离培养：巨噬细胞有多种功能, 是免疫应答中重要的抗原递呈细胞, 是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象. 该细胞易获得, 便于培养. 人巨噬细胞难以长期生长, 多用作初代培养. 目前所建立的无限细胞系大多来自小鼠, 如P388D-1 、J774A-1 、RA W309 、Cr-1 等均以恶性化, 但仍保留原有形态和吞噬功能, 易于传代和脱壁分离.巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等, 实验动物多从血液、肺、脾和胸腔、腹腔获取, 通常预先注入刺激物后再采集, 以小鼠腹腔取材法最为实用, 方法如下. 实验前 3 天向每只小鼠腹腔注入肉汤培养基1ml.引颈杀死小鼠, 手提尾将全鼠浸入70% 酒精中浸泡3-5s.置动物于解剖台上, 用针头固定四肢, 剪开腹部毛皮, 双手用镊子撕开皮肤拉向两侧, 暴露出腹膜, 切勿撕破腹膜.用70% 酒精棉球擦洗腹膜后, 用注射器吸10mlEagle 液注入腹腔中, 同时从两侧用手指揉压腹膜壁, 使液体在腹腔内充分流动.用针头轻轻挑起腹壁, 将动物微倾向一侧, 是腹腔中液体集中于针头下吸入针管内.小心拔出头, 将液体注入离心管中,1500r/min 离心10min 去上清, 加10mlEagle MEM 培养基洗2-3 次后计数.每只小鼠可产生（2-3 ）x10^7 个细胞, 其中90% 为巨噬细胞, 以2.5x109 个/L 接种培养.为纯化巨噬细胞, 去除其他白细胞, 接种数小时后, 待巨噬细胞预先充分贴壁, 此时去除原培养基, 并用Eagle 液洗瓶壁1-2 次, 再加入新Eagle MEM 培养基, 置37 ℃、5%CO2 温箱中培养.。