间充质干细胞分离及培养方案
小鼠间充质干细胞原代细胞分离及培养方案
取小鼠(C57)两只,脱颈(大镊子卡住颈部)窒息而死,75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮,取出双侧股骨,胫骨,弘骨,除去肌肉和骨膜
用含1%双抗(青霉素+链霉素)的Hanks’液冲洗三次(无菌操作)
用剪刀剪去股骨,胫骨,弘骨的骨骺端,露出骨髓腔(无菌操作)
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸(对细胞液10倍稀释,分解红细胞),进行细胞计数,根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶(塑料,带透气),37℃,5%CO2培养,48小时后换液,之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓,再吸取培养液继续冲洗,直至骨髓腔发白为止(无菌操作)
用纱布(两层纱布)在漏斗中进行细胞液的过滤,过滤到100毫小瓶子中(无菌操作)
将细胞液分到10毫升的离心管,1000转离心10分钟(无菌操作)
10毫升的M199培养基(不含双抗)对离心后的细胞进行重悬,吹打细胞时要轻(无菌操作)