４．１电子克隆与恶性肿瘤
（四）以新获得的重叠群为新的查询探针，继续 搜索ＥＳＴ数据库，直到没有新的ＥＳＴ可供拼接为 止。将拼接得到的序列对ＮＲＤＢ进行搜索，以证明
这是一个全新的序列。
２．２基于基因组数据库的电子克隆
２．２．１基因组序列
人类基因组及其他许多模式、重要物种基因组 测序工作的完成以及基于基因组序列的新基因预测 软件的开发，为人们利用生物信息学的方法克隆新 基因带来了新的策略。近年来，许多新基因就是通 过分析基因组序列发现的。 ２．２．２基于基因组数据库的电子克隆步骤 （一）选择其他物种，尤其是亲缘关系较近的物 种某基因全长ｃＤＮＡ序列或ＥＳＴ序列为查询探针， 或者以该物种某基因ＥＳＴ为查询探针，基于ＧｅｎＢａｎｋ 中的ＮＲＤＢ进行ＢＬＡＳＴ分析，从结果中筛选出同源 性较高、含外显子的该物种基因组重叠群或ＢＡＣ
【Ｋｅｙ ｗｏｒ‘ｌｓ】
Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ；
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ；
Ｂｉｏｉｎｆｂ肿ａｔｉｃｓ；
Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ
人类基因组由３×１０９个碱基对组成，编码了约 ３万个基因。如此多的基因在复制的过程中，难免有 个别基因会发生突变。现代生物医学研究已经证明， 人类疾病的发生与基因的有害突变有着密切的关 系，如恶性肿瘤、心脑血管疾病、遗传性疾病及免疫 性疾病等严重危害人类健康的疾病。因此，获得这 些疾病的差异表达基因全长序列是目前科学研究的 一个重要方面。获得差异表达基因全长序列的方法 很多，其中电子克隆（ｉｎ
国际生物医学工程杂志２０１２年１２月第３５卷第６期Ｉｎｔ ＪＢｉｏｍｄＥｎｇ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２，Ｖ０１．３５，Ｎｏ．６
电子克隆技术及其在医学领域的应用
王朝辉马小兵
【摘要】基于表达序列标签（ＥｓＴｓ）和基因组数据库的电子克隆（ｉｎ
ｓｉｌｉｃｏ
ｃｌｏｎｉｎｇ）策略，是近年发展起
来的一门基因克隆的新技术。其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸ＥｓＴｓ序列，获得基因部分乃至 全长ｃＤＮＡ序列。它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。人类疾病发生与基因的关系已经 被广泛证实，因此电子克隆技术必将成为疾病研究的重要手段。旨在阐述电子克隆技术在医学领域的应用 进展。 【关键词】表达序列标签； 中图分类号：Ｑ７８ 电子克隆；生物信息学；基因克隆 文章编号：１６７３—４１８１（２０１２）０６一０３６９—０４
３电子克隆技术的优点及局限性
为新基因，命名为ｚＨｌ、ｚＨ３、ｚＨ８、ｚＨｌ２、ｚＨｌ４、 ｚＨｌ６、ｚＨｌ７基因，这为今后进一步深入观察这些基 因的功能及其在ＰＬＣ发生、发展过程中的作用机制 打下良好的研究基础。 ４．１．２电子克隆与白血病 白血病是造血系统最常见的恶性肿瘤之一，其 生物学行为复杂多变，发生发展的分子生物学机制尚 未阐明。近年来，分子遗传学研究表明白血病是基因
生物信息技术的迅猛发展，基因序列、定位表达和功
能研究等方面都积累了大量数据，并且绝大部分都 能通过网络共享。利用这些数据资源进行电子克隆 日益成为发现新基因的主要策略Ⅲ；与此同时还可 以进一步通过验证实验纠正以往人类基因组测序中 出现的错误。因此，电子克隆技术在医学研究中被 广泛应用。１９９４年，有学者开始使用电子克隆方法 寻找新基因，１９９６年，国内也有研究者开始了对电 子克隆的研究。
（ｂｍａｄｂａｎｄ
ａｃｃｅｓｓ
４．１．１电子克隆与肝癌
原发性肝癌（面ｍａｒｙ
ｌｉｖｅｒ
ｃａｎｃｅｒ，ＰＬＣ）是我国
高发的恶性肿瘤之一。据统计，每年约有１３万人死 于肝癌，占全世界肝癌年死亡人数的４３．７％。因此， 深入认识肝癌的发病分子机制，开展对肝癌的基因 水平的研究，已经成为我国医学界基础与临床研究所 关注的焦点。Ｆ．ＬＡＮａ是一个进化上保守且在肝癌中 表达上调的肿瘤相关基因，Ｙｉｎｇ等【２】利用电子克隆 技术发现该基因编码了一种大小为２３９ ａａ的蛋白 质，从不同物种对其同源性进行分析，表明该基因是 从酵母菌到人类不断进化的。管冬元等【３】以大鼠为 研究对象，采用电子克隆技术与聚合酶链式反应 （ＰｃＲ）技术相结合的方法，成功克隆出４个与大鼠 肝癌有关的ＥＳＴ片段的ｃＤＮＡ序列，经进一步ＢＬＡＳＴ 对比分析，得出Ｇ１５、Ｇ２０、Ｇ３６、Ｇ４０ ４个基因为新基 因。健脾益气法对肝癌的治疗有一定效果，张辉等【４】 为进一步揭示健脾益气法防治ＰＬＣ的分子机制，采 用了电子克隆与ＲＴ．ＰＣＲ相结合的方法，筛选出了 与大鼠肝癌相关的１７个ＥＳＴｓ片段的全长ｃＤＮＡ序
Ｂａｎｋ收录（注册号为ＤＱ３５９７４６），为进一步研究其
功能提供了依据。白血病等恶性肿瘤细胞对多种化 学药物产生交叉耐药性称为多药耐药（ｍｕｌｔｉ．ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＭＤＲ），是造成化学药物治疗失败的主要 原因。因此，ＭＤＲ机制的探讨和逆转一直是白血病
研究中的重点、难点问题Ｍ。付劲蓉等［８】在探讨白血
ｃｌｏｎｉｎｇ）技术，又称电
ＥＳＴ概论 表达序列标签是指来源因突变的有效方法。
１电子克隆基本原理
序列，长约１５０—５００ ｂｐ。实践证明，ＥｓＴ已成为人类 寻找未知功能的新基因以及克隆各种差异表达基因 和疾病相关基因的重要标志物。近年来，ＥＳＴ数据库 容量扩增迅速，基于ＥＳＴ数据库进行功能基因的电 子克隆已经成为目前最常用的基因克隆手段，许多 新基因就是通过ＥＳＴ序列的拼接发现的。 ２．１．２基于ＥＳＴ数据库的电子克隆步骤 （一）选择其他物种，尤其是亲缘关系较近的物 种某基因全长ｃＤＮＡ序列或ＥＳＴ序列为查询探针， 或者以该物种某基因ＥＳＴ为查询探针，搜索ＥＳＴ数 据库进行ＢＬＡｓＴ（ｂｅｕ ｌａｂｓ ｌａｙｅｒｅｄ ｓｐａｃｅ—ｔｉｍｅ）比对， 得到许多ＥＳＴ序列，从中寻找感兴趣的ＥＳＴ。
万方数据
国际生物医学工程杂志２０１２年１２月第３５卷第６期Ｉｎｔ Ｊ ＢｉｏｍｅｄＥｎｇ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２，Ｖ０１．３５，Ｎｏ．６
（二）把感兴趣的ＥＳＴ基于ＧｅｎＢａｎｋ中的非冗 余数据库（ｎｏｎ
选出新的ＥＳＴ。
ｒｅｄｕｎｄａｎｔ
供的结果，最好对分析结果做人工可靠性验证；普遍 适用性较差；电子克隆后需要研究其指导合成的蛋 白质的功能才更有实际意义。
ｕｓｅ
ｂｉｏｉｎｆｂ皿ａｔｉｃｓ
ａｓｓｅｍｂｌｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄ ＥＳＴｓ ｔｏ ｇｅｔ ｐａｒｔ ｏｆ ｃＤＮＡ ａｎｄ
ｅｖｅｎ
ａＵ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｉｔ ｈａｓ ｔｈｅ ｖｉｒｈｌｅ ｏｆ ｌｏｗ
ｉｎＶｅｓｔｍｅｎｔ，ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ，ｌｏｗ ａｎｄ ｗｅＵ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ，ｅｔｃ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ
利用电子克隆方法获得新基因是生物信息学的 研究内容之一。生物信息学资源是由数据库、计算 机网络和应用软件３大部分组成；而电子克隆的应 用即是基于这３部分生物信息学资源而展开的。它 是利用计算机技术，依托现有的网络资源『表达序列
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１８１．２０１２．０６．０１３ 基金项目：河北省科学技术研究与发展计划项目（０９２７６１９２Ｄ） 作者单位：０６３０００唐山，河北联合大学基础医学院 通信作者：马小兵，Ｅｍａｉｌ：ｍ“ｉａｏｂｉｎ９００１＠１２６．ｃｏｍ
眼衣原体在上生殖道群居的能力有差别的机制， 原因可能是ＣＤ４＋Ｔ细胞造成的。Ｋｅｎｎｅｄｖ等［１７】在
治疗的靶位点。王程毅等【５】在家族性急性髓系白血 病的研究中，综合运用电子克隆技术和ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ—
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ
ｅｎｄｓ）技术克隆出了与该疾病
相关新基因的全长ｃＤＮＡ和４３２ ｂｐ的开放阅读框 架（０ＲＦ），ＢＬＡＳＴ检索为一功能未知基因，被Ｇｅｎ．
胍记肘ｅ如甜
ｓｔｒａｔｅｇｙ
ｏｆ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂａｓｅｄ
ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＥｓＴｓ）ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ
ｃｏｒｅ
ｎｅｗ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｄｅＶｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ，ａｎｄ ｔｈｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｓ ｔｏ
文献标识码：Ａ
Ｔ∞ｈＩＩｉｑｕｅ ｏｆ ｓｍｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ
ｃ０如ｇｅ矿Ｈｅ６ｅｉ‰ｉｔｅｄ№西ｅ倦咄７如＾觎Ｄ卯ＤＤＤ，吼ｉ舳
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ｄａｔａｂａｓｅ，ＮＲＤＢ）进行
ＢＬＡＳＴ分析，判断其是否为已知基因的一部分，筛 （三）将筛选出的ＥＳＴ在该物种的ห้องสมุดไป่ตู้ｓＴ数据库 中进行搜索，找到部分重叠的ＥｓＴ进行拼接，经严 格聚类分析尽量避免含有旁系同源基因，拼接后 产生的序列重叠群相当于实验中的一部分ｃＤＮＡ
步移工作。
电子克隆技术在医学领域中的应用 随着人类基因组草图的完成、数据库的建立和
电子克隆技术依靠电脑和网络资源间和节约经费，能够起到事 半功倍的效果。电子克隆技术的局限性在于：电子 克隆得到的ｃＤＮＡ序列是由计算机虚拟出来的，现 实中可能并不存在；研究人员不可完全迷信软件提 万方数据
ｃｏｎ矗肌ｅｄ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｓｉｌｉｃｏ
ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗｉｌｌ ｂｅｃｏｍｅ ｔｈｅ ｉｍｐｏｎａｎｔ ｍｅａｎｓ ｏｆ
ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ａｉｍｓ ａｔ ｅｌａｂｏｍｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｍｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．
国际生物医学工程杂志２０１２年１２月第３５卷第６期Ｉｎｔ ＪＢｉｏｍｅｄＥｎｇ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ