Artificial transcription Factor Libraries
Eliciting a Butanol-Tolerant Phenotype
Summary & Future work
丁醇生物合成途径已 成功在多类细胞中重 建 基因的优化合 提高丁醇产量 提高丁醇耐受性的 研究
pathway in Lactobacillus brevis
Berezina O V, Zakharova N V, Brand A t, et al. Reconstructing the clostridial n-butanol metabolic pathway in Lactobacillus brevis. Appllied Microbiol Biotechnol, 2010, 87:635– 646
Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae 寻找潜在宿主， Lactobacillus brevis Pseudomonas putida 构建工程 Clostridium Bacillus subtilis cyanobacteria
Using native enzymes/Heterologous expression of expression of the corresponding genes Deleting corresponding genes
背景
国内生产生物丁醇主要是以玉米为原料，利用丙酮丁醇梭 菌(Clostridium acetobutylicum)发酵，其主要产物是丁醇、 丙酮和乙醇，含量比例约为 6：3：1，简称ABE发酵 。
传统ABE发酵丁醇生产的缺点
• • • •
成本过高，价格上对石油燃料没有竞争性 发酵菌株产总溶剂较低 发酵产物中丁醇比不高 丁醇耐受性差
DNA 结合结构域多为 C2H2 型锌指结构
Developed novel artificial transcription factors (ATFs) composed of zinc finger (ZF) DNA-binding proteins, with distinct specificities, fused to an E. coli cyclic AMP receptor protein (CRP)
Thanks for your attention
CCR
Corresponding genes knockout
磷酸乙酰转移酶 ( PTA, pta)
Results
580mg/L
应用合成生物学异源重构丁醇合成途径
在酿酒酵母中重构 在大肠杆菌中重构 在乳酸菌中重构
Reconstructing n-butanol metabolic
AdhE2
AdhE2
Steen E J, Chan R, Prasad N, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factoris, 2008, 7:36-43.
1、Plasmids contain the 2μ origin of replication, LEU2D or HIS3 genes for selection, the GAL1 or GAL10 promoters, and the CYC1, ADH1,or PGK1 transcription terminators. 2、The first three genes of the 1-butanol pathway were placed on the pESC-LEU2D plasmid and the last two or four (in the case of the etfAB, bcd bearing strain) genes were placed on the pESC-HIS3 plasmid.
Lee J Y, Yang K S, Jang S A, et al. Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coli With Artificial Transcription Factor Libraries. Biotechenology and Bioengeering, 2011, 108 (4): 742 -
提高丁醇生产效率的有效技术手段



分离筛选性能优良的新菌种 过量表达菌株代谢网络的相关蛋白 敲除合成代谢副产物基因或转录阻遏蛋白的基因 利用合成生物学的方法重建丁醇生物合成途径
应用合成生物学异源重构丁醇合成途径
在酿酒酵母中重构 在大肠杆菌中重构 在乳酸菌中重构
Thl
Hbd
Crt
result
ERG10，hbd etfAB,bcd phaA,phaB
应用合成生物学异源重构丁醇合成途径
在酿酒酵母中重构 在大肠杆菌中重构 在乳酸菌中重构
Reconstructing 1-butanol metabolic pathway in Escherichia coli
Atsumi S, Cann A F, ConnorM R, et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production. Metabolic Engeering, 2008, 10:305–311.
Anzyme genes selection
C. acetobutylicum thiolase, coded by thl,
acetyl-CoA acetyltranserase from E. coli, coded by atoB
Anzyme genes selection
bcd and etfAB, from M. elsdenii ccr, from S. coelicolor bcd and etfAB, from C. acetobutylicum
异源重构丁醇生物合成途径提高其产量
报告人：silla
提纲：
1
背景
2 三种丁醇生物合成途径的异源重构 3 合成生物学的应用研究 丁醇耐受性研究 总结与展望
4
背景
• 随着石化资源的枯竭，石油价格的不断攀升，微生物发酵 生产丁醇受到了人们的普遍关注。
• 丁醇的分子式：
丁醇主要应用：溶剂、抗氧剂、增塑剂、合成药物、精细 化工等
Thl
Hbd
Adh
丁醇耐受性研究
Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coli
Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coli
Global transcription machinery engineering (gTME) is a novel method of directed evolution for improving cellular phenotype. 全局转录机制工程 (gTME） 技术正是通过基因工程方法 改造全局转录调控因子使整 个转录调控过程发生变化从 而改变或提高目标基因的转 录及表达。
Bcd＆EtfAB
Enzymes in black are from other organisms: AtoB, Escherichia coli; Erg10, S. cerevisiae; PhaA, Ralstonia eutropha; PhaB, Ralstonia eutropha; Ccr,Streptomycescollinus. The red ones are from Clostridium beijerinckii.
Artificial transcription factors(ATFs)
通常由 DNA 结合结构域与效应结构 域两部分组成, 研究发现这两个结构 域可以各自独立发生作用。基于转 录因子的这种结构特点, 可以人为地 选择针对特定序列的 DNA 结合结构 域与具有特定作用的效应结构域构 建人工转录因子。人工转录因子的
寻找优势酶， 酶基因序列人 工优化 细微调节 参考其他耐受性研 究成果进行更具体， 深层研究 用合成生物学的 方法构建利用廉 价/宽泛原料工 程菌菌
已发现与丁醇耐 受相关的基因
开发利用廉价 Feedstocks的工程 菌

Green E M. Fermentative production of butanol—the industrial perspective.Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22:337-343. Lee J Y, Yang K S, Jang S A, et al. Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coli With Artificial Transcription Factor Libraries. Biotechenology and Bioengeering, 2011, 108 (4): 742-749. Berezina O V, Zakharova N V, Brand A t, et al. Reconstructing the clostridial nbutanol metabolic pathway in Lactobacillus brevis. Appllied Microbiol Biotechnol, 2010, 87:635–646. Atsumi S, Cann A F, ConnorM R, et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production. Metabolic Engeering, 2008, 10:305–311. Steen E J, Chan R, Prasad N, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factoris, 2008, 7:36-43.