收稿日期：2008-10-18作者简介：黎林（1980-），男，广西岑溪人，韶关学院生物科学系助教，硕士研究生，主要从事蔬菜分子生物学方面的研究.摘要：初步探索了生物固氮目前的研究进展，并着重研究了豆科植物根毛与根瘤菌接触到最后形成成熟的可以固氮的根瘤组织的途径，为将来把非豆科植物，特别是禾谷类农作物转变为固氮植物的可行性提供参考.关键词：生物固氮;根瘤菌;结瘤基因中图分类号：Q939.11+4文献标识码：A 文章编号：1007-5348（2009）03-0088-04韶关学院学报·自然科学Journal of Shaoguan University ·Natural Science 2009年3月第30卷第3期Mar.2009Vol.30No.3从1862年发现生物固氮现象到目前为止，生物固氮的研究已经有一百四十多年了.期间的研究领域涉及到形态结构、细胞水平、分子水平及遗传等诸多领域.近20年来,随着分子生物学的迅速发展，生物固氮研究在国际上已取得显著进展.我国在生物固氮研究领域起步较晚.但是近年来,我国科学家在生物固氮领域不断传出好消息.在固氮菌的分类、生物学特性、固氮机理等方面取得了一定的进展.聂延富［1］利用植物生长素2,4-D 处理根系,诱导根瘤菌侵入小麦根部形根瘤的试验获得了成功.1985年,谢应先［2］等采用聚乙酶融合原生质体的方法,将具有光合固氮能力的一种蓝藻引入到烟草、玉米、水稻和小麦白化苗原生质体内等等.1生物固氮1.1生物固氮及其分类空气主要由氧气和氮气组成，其中氮气约占4/5.在自然界的千万种生物中，有一些生物能够直接吸收空气中的氮素作为养料，它们将分子态氮先还原成氨，再转化为氨基酸和蛋白质，这就叫生物固氮.豆科植物等，其根部长有许多小球，它是由根瘤菌共生形成的根瘤，就具有固氮作用；又如稻田中的水生蕨类植物满江红(俗称红萍)，由于叶腔中有固氮鱼腥藻共生而能吸收和利用大气中的氮；以上两种形式称为共生生物固氮.生物固氮的形式除共生生物固氮外，还有细菌自生固氮和联合固氮.联合固氮（又称为半共生固氮）它又分为内生联合固氮和外部联合固氮.目前已发现有固氮能力的微生物有60多属约数百种，包括细菌、放线菌、蓝绿藻等.1.2根瘤菌固氮在生物固氮中的位置以及研究现状现在已知的能够固氮的生物存在于100多个属的细菌和古菌中［3,4］,有好氧和厌氧的固氮菌、蓝细菌、与豆科植物共生的根瘤菌和与非豆科木本植物共生的放线菌等等,其中以根瘤菌豆科植物共生体系固氮能力最强(见表1).这些固氮生物在地球表面氮生态中起着非常重要的作用.据估计,当今由生物固定的氮已达2.0亿t/a ,占地表化合态氮的65%～70%,而根瘤菌豆科植物共生体固定的氮又占生物固氮量的65%以上.根瘤菌固氮指的是根瘤菌属（Rhizobium ）的细菌，与豆科植物建立共生关系，它侵染豆科植物的根部，形成一种具有复杂结构和高度分化的特殊的植物器官———根瘤，在根瘤提供的厌氧环境中将分子态氮还原生物固氮的研究现状初探黎林1，2（1.西南大学园艺园林学院重庆400716；2.韶关学院生物科学系，广东韶关512005）第3期成氨.利用根瘤菌接种豆科植物以提高其固氮效率已有100多年历史,现在世界各国均在增加豆科植物播种面积,并接种根瘤菌.据FAO 统计,近40年来,美国大豆种植面积增加了1.5倍,巴西增37倍,印度增357倍.美国种植苜蓿,80%接种根瘤菌;至1997年,美国靠豆科植物(苜蓿、大豆、花生)固定的氮已占其农田输氮总量的1/3.巴西种大豆均不施氮肥,只接种根瘤菌,却可增产30%,卢旺达用根瘤菌接种豆科作物,增产40%～60%.我国在20世纪50～70年代,也进行过较广泛的根瘤菌接种豆科作物的实验,效果很好.后来,化学氮肥大量上市,豆类种植面积减少了,根瘤菌接种事业濒于消亡.中国农业大学根瘤菌分类及应用课题组从20世纪70年代开始,进行我国豆科植物根瘤菌资源和分类的基础研究［5］.受国家科委、教委,特别受国家自然科学基金委持续资助,曾组织全国20个单位100多人(次)完成了全国32个省(市)不同生态条件下豆科植物结瘤情况调查,从600多种豆科植物上分离、保藏根瘤菌6000多株,其数量及宿主种类之多居国际首位.对其中1500多株菌进行了100多项表型和遗传型性状分析,发现了一批耐酸、耐碱、耐盐、耐高温、低温下亦生长的抗逆性很强的珍贵种质资源,是根瘤菌选种的最好材料.同时,用多相分类技术对这些菌株进行了分类和系统发育研究,描述并发表根瘤菌新属2个［中华根瘤菌属(Sino rhizobium )和中慢生根瘤菌属(Meso rhizobium )］,新种15个,还有9个新种待发表.更重要的是从分类的角度认识到豆科植物与根瘤菌共生关系的多样性.表1豆科植物固氮量2豆科植物与根瘤菌共生结瘤2.1豆科植物与根瘤菌共生结瘤的过程［6-8］（1）豆科植物分泌信号促使根瘤菌正趋化并分泌结瘤因子；（2）结瘤因子与凝集素特异性地相互作用，发生根毛卷曲；（3）根瘤菌在根毛卷曲处进入细胞后形成侵入线；（4）根皮层细胞分裂形成根瘤原基；（5）根瘤原基分化形成根瘤组织，最后形成成熟的固氮根瘤菌.2.2根瘤菌的结瘤机理根瘤的发生是由细菌的根瘤基因（nod genes ）控制的［9］.并且至少需要30种以上的植物根瘤蛋白质（nodulins ）的参与.在根瘤内部，根瘤细菌发育成为能固氮的多型的“类菌株”（bacterioid ）.固氮过程既需要细菌蛋白，也需要植物蛋白.细菌蛋白由nif 基因编码，总数17个nif 基因分属于8个操纵子［10］.这些操纵子合成氧敏感的固氮酶复合体和电子传递链的组分.大多数植物蛋白的功能，迄今仍不清楚，但根瘤中主要蛋白植物固氮量/kg ·hm -2·a -1三叶草(Trifolium )45～670大豆(Glycine max )60～300豌豆(Pisum )50～500苜蓿(Medicago )90～340羽扁豆(Lup in )140～200花生(Arachis )50～150蚕豆(Vicia )100～300小扁豆(Lens culinaris )50～150固氮树种(Woody legumes )80～500具喙田菁(Sesbania rostrata )60～800黎林：生物固氮的研究现状初探·89·韶关学院学报·自然科学2009年之一是植物豆血红蛋白（leghaemoglobin），通过它与氧的结合作用，可以使固氮酶复合物免受氧的失活作用，而保持正常的活性.此外，在根瘤中还存在有植物尿酸酶、黄嘌呤脱氢酶和谷氨酰胺合成酶等涉及铵代谢的酶类（见图1）.2.3把非豆科植物转变为固氮植物的可能性把非豆科植物，特别是禾谷类农作物转变为固氮植物，这是植物基因工程的另一个引人注意的目标［11］.要使普通的非固氮植物的细胞，从遗传上转变为具备固氮能力的特殊细胞必须具备如下5个方面的条件：A、固氮菌的全部nif基因都应能在同一个植物细胞中适当地表达.B、固氮酶复合体能够恰如其分地加工和组装.C、具有一个厌氧的环境.D、提供ATP.E、提供NADPH.这是一项十分复杂而艰巨的工作.一种可能的途径是用带有nif基因的质粒转化植物细胞的叶绿体，从而有可能使用正常的原核信号进行表达，而不必将17种nif基因置于植物细胞核启动子的控制之下.然而即便在这样的情况下，固氮酶的氧抑制作用仍然是一个难以解决的问题.另一种看来最有希望的方法是应用基因工程技术，把豆科植物的根瘤基因导入其它植物细胞，使之能够对固氮菌的感染做出恰当的反应.到目前为止，许多植物的根瘤蛋白基因（nodulin genes）都已经被克隆出来，而且以豆科植物三叶草（Lotus corniculatus）为材料的一种研究根瘤形成的模型也已经建立.3结语当前,国外生物固氮研究已进入一个新阶段，其特点是多学科交叉，将基础研究和应用前景相结合，开拓了思路.生物固氮研究正在分子和原子水平上开展，如：固氮基因表达的氨阻遏和氧敏感机制；共生结瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控；根瘤菌结瘤因子的结构和生物合成；根瘤菌及其宿主植物的基因组学转录组学和蛋白质组学;固氮酶的结构和功能及其化学模拟；固氮效率的提高及其在农业和环境保护中的应用，最终把固氮基因直接导入到非豆科植物［12］.这些研究要求生物学、农学、化学和物理学等学科的交叉结合，引入新概念和新技术,综合进行，这些任务的解决，对人类社会带来的益处是何等的巨大，这在目前是难以预料的.第3期黎林：生物固氮的研究现状初探·91·参考文献:—化学因子2,4-D诱导根瘤菌在小麦上结根瘤［J］.自然杂志,1983，6（5）：326-336.［1］聂延富.关于诱导无根瘤植物结根瘤的研究——［2］谢应先，陈婉华.用细胞融合法组建新固氮植物的可能性［J］.中国农业科学,1985,17(04):92-95.［3］娄志义.生物固氮研究的大事记［J］.生物学教学,2005,30(4):60-61.［4］陈文新，陈文峰.发挥生物固氮作用减少化学氮肥用量［J］.中国农业科技导报,2004,6(6):3-6.［5］刘晓云，陈文峰，陈文新.根瘤菌的系统发育及其分类研究进展［J］.微生物学通报,2003,29:73-76［6］Kumagai H,Kinoshita E,Robert W,et al.RNAi Knock-Down of ENOD40s Leads to Significant Suppression of Nodule Formation in Lotus japonicus［J］.Plant Cell Physiol,2006,47(8):1102–1111.［7］Sauviac L,Niebel A,Boisson-Dernier A L,et al.Transcript enrichment of Nod factor-elicited early nodulin genes in purified root hair fractions of the model legume Medicago 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into non-legumes,especially the corniness.Key words:biological nitrogen fixation;Rhizobium;nodulin genes（E D.:S,Z）。