• 二个平齐末端。
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三、载体
• 载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载 工具。
DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色 体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。
• 载体的条件：
①.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源
DNA一起复制。
②.具多克隆位点，即有多种限制酶的切点；且切点不存
已批准环境释放的有49个品种，涉及水稻、玉米 、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨 树、烟草等10种作物。
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• 3．基因工程研究内容： ①．从细胞和组织中分离和纯化DNA；
•
②．利用能识别特异性DNA 序列的限制性内切酶剪切
DNA分子，制备含有目的基因的DNA片段，或采用酶学和
第九章 基因工程和基因组学
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• §1．基因工程(Gene engineering)
一、基因工程概述
• 1、基因工程的概念
• 20世纪70年代随着DNA重组技术的发展在遗传学上产生 了一门新的分支遗传工程（ Genetics engineering ）
• 遗传工程:又称遗传操作（Genetic manipulation）,是以 分子遗传学为 基础，以现代物理、化学等为手段，按照 人们设 计的生物蓝图在细胞、染色体和基因等不同水平 上，对生物的遗传性状进行定向改造，创造新的生物类型 。
化学合成的方法人工合成基因；
③．将DNA片段或人工合成的基因与能够自我复制并 具有选择标记的载体在体外连接，形成重组DNA分子；
④．将重组的DNA分子引入受体（宿主）细胞中，使 重组DNA分子在受体细胞内复制，产生多个拷贝，即克隆 ；
⑤．重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞中 ，使子代群体细胞均具有重组的DNA分子的拷贝；
• 广义的遗传工程：包括细胞工程、染色体工程、
•
细胞器工程、基因工 程。
• 狭义的遗传工程：即基因工程
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•
• 2.基因工程的发展：
基因工程的产生和发展在遗传学的发展史上是一次大革命，它打 破了种、属的界线，可以在生物大系统内交流基因。其发展情况如下：
• 1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能
此酶由500kd的四∆M15）
受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨 基端有缺失（缺失肽），不能形成4 聚体的活性酶，不能分解X-gal
受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1blue、XS127、XS101、KK2186、 MV1184、DH5a
3）载体lacZ’与互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码肽与这个 缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使 它能形成4聚体，从而能分解X-gal，产 生蓝色物质。
在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记
性状的表现。
③.至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与
否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基
因。
④.易从宿主细胞中回收克隆。
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• 一些常用的载体：
• ㈠、细菌质粒 ：
• 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然 存在的、能自我复制、易分离和导入的环状 双链DNA分子，是质粒具有重组表型检测标 记，可检测是否携带外源DNA片段。
⑥．从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定含有目标基因 的重组DNA，受体细胞的克隆；
•
⑦. 能从选出的宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重
组的DNA分子；
• 2021/3/13⑧.克隆的基因能够正常表达。
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• 这类酶的切割点是对称序列。如回文对称 序列（又称反向重复序列，即从两个方向 阅读，其序列相同的序列）。识别特定的 碱基序列，交错切割产生二个粘性末端。
（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于 选择标记Tetr的内部）
抗菌素选择原理
含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 能够生长抗菌素抗性基因的受体菌
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌 后，受体菌才能生长。
抗性基因
死
抗菌素
活
• 另：pUC18质粒具有以下特点：
①. 分子量小，可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多，500个／细胞； ③. 克隆位点的酶切位点多，克隆方便； ④. 具有用于检测重组质粒的选择标记
•
（如α–互补的显色表型）
•。
•
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③ lacZ的肽互 补
1）-肽（ lacZ’ ）：
-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸）。
4聚体
N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa
C端大部分 C端大部分 C端大部分 C端大部分
•
酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。
1972年 伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体
•
DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 得到新的DNA分子。
1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人
的胰岛素投放市场。
• 自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获 得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。
• 可用于克隆分子量小于10kb(1kb=1000bp)的 外源DNA片段。
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经典的大肠杆菌质粒载体
1. pSC101
第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质 粒载体。
（1）类型 天然质粒，属低拷贝型。
（2）长度 9.09 kb （3）选择标记 四环素抗性Tetr
（4）克隆位点
6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、 BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。
• 1996年，克隆羊诞生。
• 2004年3月英国批准大面积种植转基因，但要求非常严格。
• 2005年德国通过法案，严格限制（包括实验室研究）。
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目前世界转基因作物主要为大豆、玉米、棉花和 油菜等，以转基因大豆面积最大。
我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的 国家。到1999年我国已批准中试的转基因作物有48 项：包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜 、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等11种作物； 主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏 和抗衰老等。