水蛭素的核心环肽结构如下：
• 1986年科学基酸 密码子 基因探针 提取基因
2、选择基因载体获得重组DNA
• 在体外将含目的基因的DNA片段和具 有自我复制功能、并带有选择标记的 载体分子进行酶切连接，获得重组 DNA分子。 • 可以作为载体的主要有质粒、噬菌体、 黏粒、病毒载体等。
水蛭素
在古代医书《神农 本草经》中早有水 蛭素的记载，为我 国传统中药。中医 认为它有破血、逐 瘀、通经的功能。 它是迄今为止所发 现最强的凝血酶天 然特异抑制剂。
水蛭素的临床应用
• 预防外科手术后的静 脉血栓形成 • 预防和治疗（阻断） 急性或慢性血管内凝 血（DIC） • 预防血栓溶解后再栓 塞 • 预防经皮血管腔内形 成术（PTCA）后的再 狭窄 • 作为透析和体外循环 中的抗凝剂
基因工程技术获Leabharlann 水蛭素• 1、获得具有遗传信息的目的基因 • 2、选择基因载体获得重组DNA • 3、将重组DNA分子导入宿主细胞 • 4、鉴定带有目的基因的克隆 • 5、目的基因的扩增及获得目的产物
1、获取目的基因
现已知水蛭素有11种类型，其中3种具 有抗凝血活性，它们分别命名为HV1、 VH2和VH3。 天然水蛭素是酸性多肽，其一级结构中 含有6个半胱氨酸，形成3对链内二硫键， 位于肽键N端；另一特点是在63位酪氨酸 处有硫酸酯化。
• 导入方法：
该菌主要采用形成圆 球体、在有氯化锂和 聚乙二醇-1000的条件 下用整体细胞以及电 穿孔等方法进行基因 转化。
• 载体选择：
毕赤酵母载体均为大 肠杆菌-毕赤酵母穿梭 质粒。故在上一步的 载体选择中应选取质 粒。
4、鉴定带有目的基因的克隆
• 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有 重组DNA分子的寄主细胞。 • 方法： 采用各自特有的测活方法确定其生物活性； 采用酶联免疫方法确定其抗原性； 以目的基因为探针，通过DNA杂交方法可以 直接确定重组子。
先进的科学技术为人工合成 大量的水蛭素提供了可能。随 着研究的不断深入，水蛭素的 应用价值将不断被开发，并为 血栓患者带来福音。
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
毕赤酵母的 载体多数以 组胺醇脱氢 基因(HIS4) 作为选择标 记。
5、目的基因的扩增及获得目的产物
• 将重组基因导入受体细胞，使其在新的遗 传背景下获得活性表达，从而得到人类需 要的特定目的物质。
表达的条件
• • • • ①选择合适的载体。 ②表达盒整核位点。 ③要注意选择表达菌株的类型。 ④一般情况下，外源基因整合的拷贝数越 高则蛋白表达量越大。 • ⑤外源蛋白对蛋白酶的耐受性与否直接影 响蛋白产量。 • ⑥其他如发酵培养基、通气量、甲醇量等 均会对基因表达产物量造成重要影响。
• 由于水蛭素具有重要开发价值，而水蛭的 来源有限，故国内外医药界均着重研究通 过基因工程获得重组水蛭素。 • 现国外一些大的生物技术公司对水蛭素己 进入多方面的临床研究。有关水蛭素类多 肽的专利，每年公布的数量至少在十多项 以上。 • 1998年底重组水蛭素药物在德国正式上市， 1999年英国批准上市，己注册的国家有美 国、欧洲、澳大利亚、新西兰、南非等I0多 个国家。
3、将重组DNA分子导入宿主细胞
采用特定方法将重组DNA分子转移至 适当宿主细胞，并与之同步增殖。 宿主细胞通常为大肠杆菌和酵母菌。 导入方法主要有转化、转染等，也可 采用电融合、显微注射和基因枪等技 术。
采用酵母（毕赤酵母）作为导入细胞 一般不用大肠杆菌作为受体细胞 ⑴真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和 1、需在N端加一个蛋氨酸作为翻译的起始密 翻译后修饰； 码，含有多余氨基酸的重组水蛭素活性大大 ⑵表达量高； 降低。 2、水蛭素在大肠杆菌细胞中蛋白质降解作用。 ⑶较其他真核表达体系成本低，只需含盐的 简单培养基； ⑷适于高密度培养； ⑸杂蛋白少，产物纯化较易。
影响酶的因素
• 限制性内切酶（Ⅱ型） 缓冲液：镁离子是酶活性的绝对必需条件，还有氯 化钠、二硫苏糖醇及牛血清白蛋白等。 温度：不同限制性内切酶具有不同的最适温度，多 数为37℃。 • DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶：以NAD+作为能源 T4噬菌体DNA连接酶：以ATP作为能源 温度：以T4 DNA连接酶为例，连接粘端DNA最佳 温度为4~15℃。