大肠杆菌的特点与前景研究摘要：肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。

直到20世纪中叶，才认识到一些特血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物。

大肠杆菌属于细菌。

关键词：大肠杆菌病原性应用前景大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。

是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。

大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。

在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。

大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。

大肠杆菌O157：H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括中国等许多国家都有报道，且日见增加。

日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目。

在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位。

大肠杆菌O 157：H7引起肠出血性腹泻，约2%～7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。

致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危及生命。

大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。

周身鞭毛，能运动，无芽孢。

能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。

正常栖居条件下不致病。

但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。

在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。

在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。

若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。

因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。

（国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个）大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。

根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。

大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。

莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。

大肠杆菌（E. coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。

一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。

某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。

该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。

在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。

胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。

对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。

耐酸机制研究人员在新研究中证实，L-谷氨酰胺通过酶促反应释放氨，使得大肠杆菌获得了耐酸性。

在三种已知的ARs中，AR1的功能机制仍然不清楚。

相比之下，AR2和AR3的分子机制得到了更深入地解析。

AR2包含有一个氨基酸反向转运蛋白GadC，负责细胞外L-谷氨酸(Glu)与细胞内γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid ，GABA）的交换。

两个Glu脱羧酶GadA 和GadB将Glu转变为GABA。

与AR2相似，AR3也具有两个组件：反向转运蛋白AdiC和精氨酸脱酸酶AdiA。

AR2或AR3一次完整的循环可将细胞质中的质子排出至细胞外环境中，由此提高细胞内pH，促进细菌在酸性环境下存活。

全面了解细菌AR对于有效的临床预防及治疗均有重要的意义。

因为所有的食物传播性致病菌都必须通过极酸性胃，了解细菌在pH 值为2-3的环境下的生存机制极其重要。

当前，研究人员对于这些机制的了解还远远不够。

在这项研究中，研究人员鉴别了一个新型大肠杆菌耐酸性系统，证实其依赖于谷氨酰胺酶YbaS和氨基酸反向转运蛋白GadC。

这种YbaS和GadC可被酸性pH激活，且只在pH值小于等于6.0时才能适当发挥功能。

通过吸收L-谷氨酰胺(Gln)，大肠杆菌利用YbaS将之转化为L-谷氨酸(Glu)，伴随释放气态氨。

游离氨中和质子，导致酸性环境下细胞内pH增高。

GadC则负责细胞外Gln 与细胞内Glu 交换。

通过这一耐酸系统，确保了大肠杆菌在极酸性环境下生存。

1、定居因子（Colonizationfactor,CF）：也称粘附素(Adhesin)，即大肠杆菌的菌毛。

致病大肠杆菌须先粘附于宿主肠壁，以免被肠蠕动和肠分泌液清除。

使人类致泻的定居因子为CFAⅠ、CTAⅡ(ColonizationfactorantigenⅠ、Ⅱ)，定居因子具有较强的免疫原性，能刺激机体产生特异性抗体。

大肠杆菌具有很多毒力因子，包括内毒素，荚膜，〣型分泌系统，黏附素和外毒素等。

（〣型分泌系统是指能向真核靶细胞内输送毒性基因产物的细菌效应系统。

约由20余种蛋白质组成。

）2、黏附素能使细菌紧密黏着在泌尿道和肠道的细胞上，避免因排尿时尿液的冲刷和肠道的蠕动作用而被排除。

大肠杆菌黏附素的特点是具有高特异性。

包括：定植因子抗原〡，〢，〣；集聚黏附菌毛〡和〣；束形成菌毛；紧密黏附素；P菌毛；侵袭质粒抗原蛋白和Dr菌毛等。

3、外毒素大肠杆菌能产多种的外毒素，包括：志贺毒素〡和〢；耐热肠毒素〡和〢；不耐热肠毒素〡和〢。

此外，溶血素A在尿路致病性大肠杆菌所致疾病中有重要作用。

4、肠毒素：是肠产毒性大肠杆菌在生长繁殖过程中释放的外毒素，分为耐热和不耐热两种。

不耐热肠毒素（Heatlabileenterotoxin,LT）：对热不稳定，65℃经30分钟即失活。

为蛋白质，分子量大，有免疫原性。

由A、B两个亚单位组成，A又分成A1和A2，其中A1是毒素的活性部分。

B亚单位与小肠粘膜上皮细胞膜表面的GM1神经节苷脂受体结合后，A亚单位穿过细胞膜与腺苷酸环化酶作用，使胞内ATP转化cAMP。

当cAMP增加后，导致小肠液体过度分泌，超过肠道的吸收能力而出现腹泻。

LT的免疫原性与霍乱弧菌肠毒素相似，两者的抗血清交叉中和作用。

耐热肠毒素（Heatstableenterotoxin,ST）：对热稳定，100℃经20分钟仍不被破坏，分子量小，免疫原性弱。

ST可激活小肠上皮细胞的鸟苷酸环化酶，使胞内cGMP增加，在空肠部分改变液体的运转，使肠腔积液而引起腹泻。

ST与霍乱毒素无共同的抗原关系。

肠产毒性大肠杆菌的有些菌株只产生一种肠毒素，即LT或ST；有些则两种均可可产生。

有些致病大肠杆菌还可产生vero毒素。

病原体大肠杆菌O157:H7是大肠杆菌的其中一个类型，该种病菌常见于牛只等温血动物的肠内。

这一型的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症状，如带血腹泻。

大肠杆菌血清学分型基础（即其抗原）大肠埃希菌主要有三种抗原：O抗原，为细胞壁脂多糖最外层的特异性多糖，由重复的多糖单位所组成。

该抗原刺激机体主要产生IgM类抗体（出现早，消失快）。

K抗原，位于O抗原外层，为多糖，与细菌的侵袭力有关。

K抗原分为A，B，L三型。

H抗原，位于鞭毛上，加热和用酒精处理，可使H抗原变性或丧失。

H抗原主要刺激机体产生IgG类抗体，与其他肠道菌基本无交叉反应。

表示大肠杆菌血清型的方式是按O：K：H排列，例如：O111：K58（B4）：H2外源基因在大肠杆菌中的表达【1】将外源DNA或目的基因与表达载体构建成DNA重组体，转化大肠杆菌后外源蛋白表达定位于胞内，是常见的表达方式。

1．直接表达：即非融合蛋白表达。

将外源基因插到原核表达载体强启动子和有效sD序列下游，以外源基因mRNA 的AuG为起始翻译，表达产物位于胞内，氨基端和羧基端不含其他蛋白或多肽序列。

小分子蛋白较易表达，产物接近天然蛋白，但易被水解，不稳定。

当外源基因在大肠杆菌高效表达，特别是表达出大分子蛋白时，则易在胞内形成包涵体。

1．1包涵体的形成及利用包涵体是由蛋白肽链错误折叠形成的不溶于水的非结晶性蛋白聚集体。

通常一级结构正确，但其立体结构有误；无生物学活性或活性很低，需变性、复性才可能得到活性蛋白。

包涵体的分离方法简单(差别离心、洗涤等)，其形成可减轻外源蛋白对宿主的毒害，如果复性成本又较低，可考虑促进包涵体的生成以获取大量表达产物。

外源基因在菌体内表达成有天然构象的蛋白，需一系列蛋白因子辅助。

包涵体形成可能主要与二类分子数量不足有关，也与蛋白折叠时环境条件密切相关【2】。

1．2蛋白肽链折叠与蛋白因子辅助菌体内有二类分子参与肽链折叠：分子伴侣是高度保守和分布广泛的蛋白，能帮助新生肽链折叠和转运，稳定蛋白质的未折叠状态和中间折叠状态，防止分子内和分子间不合适的相互作用，但不直接参与二级结构的构成。

大肠杆菌分子伴侣包括GmEL、GroEs、DaIlK、DallJ、GrpE、GrpE、HtpG等【2,3】。

折叠酶是另一类辅助蛋白，催化与折叠有关的化学反应，包括Dsb(二硫键催化酶)系列、PPIase(肽基脯氨酸顺反异构酶)等。

DsbA、DsbB等催化大肠杆菌中二硫键的形成【4】，PPIase催化折叠过程中起限速步骤的顺反式异构反应，使肽链折叠时脯氨酸残基由顺式变为反式【2】。

Lee等将GroEs／EL、DaIlK与原胶原酶在大肠杆菌中共表达或融合表达，以增加辅助蛋白肽链折叠的分子，可以提高后者的折叠效率和可溶蛋白的产量，防止形成包涵体【5】。

不同蛋白质成熟途径不同，可能涉及不同的蛋白因子对蛋白质折叠起作用。

随着人们对折叠过程和机制的更深了解，能使更多蛋白实现胞内表达。

在生物技术中的应用大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。

目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系在这里必须指出的是，处于生物安全考虑，生物工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。

这些菌株由于失去的细胞壁的重要组分，所以在自然条件下已无法生长。

甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。

这样，即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。

此外，生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆实验真核基因在大肠杆菌中表达，必须有合适的表达载体(Vector),常用载体：pBV220,pET系统目的基因在大肠杆菌中表达的情况：大肠杆菌更适合原核基因的表达，外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的，而单位体积产量与细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相相关.细胞浓度与生长速率，外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在动态平衡，单个细胞的产量又与外源基因拷贝数，基因表达效率，表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。