基因工程制药综述

班级：生技132

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大肠杆菌表达系统的研究进展综述

自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。 尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近 年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。

1 表达载体

1. 1 表达调控

构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体内过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、 RNA 转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1] 。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合 理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2] 。目前应用的表达载体主要问题是 表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是 非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3] 。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体 pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4] 。

1. 2 融合表达载体

除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om

pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。 另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5] 。常见的纯化标签多根据亲和层析的配体来选择,如 6H is、GST 、CAT 、MBP 等经过一步亲和纯化可以得到均一性较高的产物, 但化学洗脱会对产物的活性产生一定的影响。Ca2+依赖的钙调蛋白结合肽(CBP)和链球菌亲和素结合肽(SBP)作为纯化标签时, 只需要在洗脱液中移去标签依赖的离子或小分子就能实现温和的特异性洗脱[6 ,7] 。再者, 应用一些非层析的纯化标签在纯化操作中非常经济实用, 如热敏型的类弹性蛋白多肽 (ELPs)可以使蛋白产物在溶解态和非溶解态之间转变,

后续应用逆转循环的纯化方法可以达到亲和纯化的回收率[8] 。另外,在纯化标签与目的蛋白之间插入一些特殊的短肽,同时融合剪切酶可以在纯化操作中利用标签的自剪切直接得到产物蛋白。 例如 SrtAc 酶所识别的短肽序列 GTEPL, 在蛋白 N 端依次连接短肽、剪切酶、6His 融合表达,亲和上柱后剪切酶发挥作用使 N 端带有 Gly 的目的蛋白从融合状态中释放出来[9] 。噬菌体展示库是表达抗体或其它蛋白库的重要克隆技术, 与之相似将目的基因同适 合的锚定序列融合可以使产物蛋白表达到大肠杆菌的表 面。大肠杆菌展示所用的融合配体一般为细菌的膜蛋白或跨膜转运体,如 PadL 是大肠杆菌长链脂肪酸的一种外 膜转运体蛋白,N 端融合 PadL 表达胞内酶,以全细胞的形式催化反应表现出非常高的稳定性[10] ；Yang 等利用恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida 外膜酯酶 EstA 的转运结构域作为表达胞内β-内酰胺酶的锚定基序, 结果表明蛋白展示在细胞膜外并没有影响细胞的活力[11] 。

1. 3 共表达载体

很多真核基因表达的产物都必须以多聚复合体的形式组合才能表现出相应的活性, 因此在表达这一类目的基因的时候常构建共表达载体,另外共表达的策略在辅助新生蛋白质的折叠和分泌中也很有意义。Dzinenu 等针对表达异源 二聚体构建 了可以同 pET 载体 共表达的 载体 pOKD ,这种载体含有 p15A 复制起点, 所以可以和大多数大肠杆菌表达载体共存于细胞中[12] 。 细菌释放素蛋白 (BRP)属于细菌中的一类分泌蛋白, 共表达目的蛋白与

BRP 可以促进产物直接释放到培养基中[13] 。另外,共表达 分子伴侣也是促进蛋白正确折叠的手段。目前对于分子伴侣构成的网络模式还处于探索阶段, 研究发现大肠杆菌中常见的分子伴侣 GroEL、H sp 同系物 DnaK 并非细胞内所有蛋白折叠所必需的, 只有同核糖体结合的触发因子协调作用才能促进蛋白的适当折叠[13] 。但是, 合理选择个别的分子伴侣共表达可以避免产物在细胞内错误的折叠以及沉积。M arco 等设计了共表达分子伴侣的 3 载体系统, 其中两种载体分别携带不同的分子伴侣, 另外一种载体携 带目的基因, 分子伴侣与目的基因被分别独立诱导[14] 。 Cpn60 和 Cpn10 是从嗜冷菌中分离的一类分子伴侣, 共表达后可以使大肠杆菌在 4℃低温下生长, 有利于蛋白的正确折叠[15] 。与分子伴侣类似, 共表达 DsbA 或 Dsbc 等二硫键相关蛋白可以辅助形成正确的二硫键。

1. 4 双杂交系统

融合表达和共表达的另一个应用是利用双杂交系统研究蛋白质的相互作用。大肠杆菌双杂交系统也是有 3 种 载体构成,诱饵蛋白融合表达载体、捕获蛋白融合表达载 体和报告基因表达载体[16] 。以 AraC /LexA 双杂交系统为 例,诱饵载体的启动子选用 IPTG 诱导的 pT

rc, 诱饵蛋白融合在转录激活因子 ArcC 的 N 端表达, 带有卡那霉素的抗性基因; 捕获载体的启动子选择非IPTG 诱导的 pTet,可以在去水四环素的诱导下转录, 捕获蛋白融合在

LuxA 操纵子效应物 LuxA 的 N 端, 带有氨苄青霉素的抗性基因; 报告基因 LacZ 的启动子选用大肠杆菌的 araBAD 启动子, 其活性依赖于上游的 AraC 操纵子, 同时在启动子下游安置 3 个定向重复的 LexA 操纵子半位点, 载体带有大观霉素的抗性基因,另外在 AraC

上游插入 4 个串联的 rrnB 终 止子,减小转录通读对报告基因活性的背景影响。此 3 载

体共表达系统的特点是诱饵蛋白同捕获蛋白分别独立诱导,可以通过控制诱导物的浓度逐步放大杂交蛋白相互作用对报告基因表达的抑制效应。诱饵蛋白与捕获蛋白分别结合在上游和下游的 2 个操纵子上, 如果二者可以发生杂交作用, 则在报告基因的 DNA 链上形成突环,

使 AraC 转录激活效应发生逆转, 所以通过菌落的蓝白斑差异可以筛选出发生相互作用的蛋白质。

1. 5 Univector 系统

通常在构建重组子表达时需要依赖限制性内切酶和连接酶的作有, 进行亚克隆, 而利用同源重组开发的载体可以实现基因的一次性克隆。Univector 表达系统(UPS) 就是这方面较为成功的实例[16] 。Univector 系统由两类载体组成(图 1): 一种称为万能的进入载体

pUN1, 具有特殊的 loxP 重组序列,通过重组酶 Cre 可以方便地穿梭进入表达载体; 另一种即表达载体 pHOST , 同样具有 loxP 序列, pHOST 是由不同的启动子与融合标签组成的载体系列, 便于高通量筛选蛋白产物。 Univector 系统的特点是平行独立克隆到多载体中,

使之在不同的诱导条件下表达, 大大提高了表达的成功率, 尤其在蛋白组的研究中具有很大的应用潜力[3] 。

2 宿主细胞

在大肠杆菌细胞内表达目的基因的主要优势: 一个是宿主的遗传背景比较清楚, 易于控制基因的表达; 另一个是大肠杆菌容易培养, 可以获得较高产量的目的蛋白。但是在商业应用中很多的蛋白产物是真核基因编码, 并且具有高级的三、四级结构, 要求翻译后加工为正确的折叠形式或者糖基化蛋白等。由于大肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核细胞具有很大的差异, 所以在应用大肠杆菌系统表达真核基因时有必要利用代谢工程或进化的

方法改造细胞, 解决大肠杆菌表达系统的局限性, 提高产物的活性。

2. 1 代谢工程

载体携带目的基因进入宿主表达会给宿主本身造成代谢上的负担, 影响细胞的生长速率等, 推测可能是因为宿主不能提供足够外源基因表达所需的原料及能量。减轻表达对于宿主的压力可以通过控制质粒的拷贝数或者改变载体的抗性基因,还可以将目的基因直接插入染色体中表达。Flores 等则是将磷酸戊糖途径的代谢关键酶—6磷酸葡萄糖脱氢酶的基因克隆到多拷贝质粒中, 转化大肠杆菌使细胞的生长速率在诱导后得到恢复[17] 。 除了利用大肠杆菌的代谢机制改进表达系统 ,另外还可以人为地在大肠杆菌中设计代谢途径, 例如

Masip 等设计的二硫键合成途径。在大肠杆菌中催化二硫键形成的是周质蛋白 DsbA ,此蛋白通过膜蛋白 DsbB 得到循环利用。 Masip 等选择硫氧化还原蛋白 TrxA 作为二硫键的供体, 使之在氧化态的胞质内形成二硫键, 通过融合 Tat 特异性前导肽从细胞质转运到周质,使重组蛋白在周质获得二硫键。因此这一途径不依赖 DsbADsbS 体系,仅通过胞内的硫氧化还原蛋白就能形成二硫键,所以可以修复缺失 DsbADsbB 体系 的宿主[18] 。

2. 2 定向进化

通常重组蛋白对于细胞内的蛋白酶都很敏感,为了避免蛋白酶的作用除了分泌表达外还可以对相关的蛋白酶进行突变,例如筛选缺乏 ATP 依赖的胞内蛋白酶的菌株, 但是对于是否细胞因此而上调其它的蛋白酶浓度还不清楚。另外在周质中的蛋白酶也会降解产物蛋白,

DegP 蛋白是存在于细胞周质中的主要蛋白酶, 所以可以应用 degP 失活的宿主表达蛋白。同时,C 端为非极性的蛋白应该在 prc 突变的宿主中表达(Prc 蛋白酶作用于 C 端非极性的蛋 白), 或者以 N 端融合形式表达[19] 。前文已经提到过选择 分子伴侣的问题,利用定向进化的方法分离分子伴侣或折叠因子的变异体,可以针对重组蛋白进行高效的特异性折 叠。Weissman 等对大肠杆菌进行多轮的 DNA 改组和筛选,分离出的 GroEL 突变体提高了对绿色荧光蛋白的折叠效率[20] 。另外,定向进化的方法还可以扩大大肠杆菌的遗传密码,在蛋白中添加非天然的氨基酸。决定氨酰 tRNA 合酶催化 tRNA 携带正确氨基酸的因素是不同于氨酰化位点的一个编辑位点。通过对染色体的随机诱变,筛选出一类突变体可以催化 tRNAVal

结合Ser,并且20%细胞内的 Val都被类似于 Ser 的氨基丁酸取代[21] 。 Schultz 等向大肠杆菌中引入一对特殊的 tRNA /氨酰 tRNA 合酶, 掺入对琥珀密码子应答的甲基化酪氨酸,

在表达二氢叶酸还原酶的实验中发现,由于非天然氨基酸的存在使基因翻译的保真度达到99%[22] 。

2. 3 蛋白质的糖基化

很长时间以来 , 大肠杆菌被认为不能表达糖基化蛋白,因为原核细胞普遍缺乏糖基化功能。而在真核细胞中,大多数分泌蛋白都在翻译后加工过程中获得 N 端的寡糖链。寡糖(Glc3Man9GlcAc2)被类脂运载体转运到蛋白的 N 端, 由寡糖转运酶催化寡糖与天冬酰氨或丝氨酸/苏氨酸残基形成 N 连接或 O 连接。空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是目前发现的唯一具有类似真核糖基化代谢功能的原核生物, 其基因组中的 pgl 基因簇编码的蛋白类似于真核细胞中的糖基转移酶。Wacker 等将空肠弯曲杆菌的糖基化基因克隆到大肠杆菌中表达,结果 pgl 编码的蛋白 PglB 可以指导质粒编码的 AcrA 蛋白的糖基化。 通过对表达产物的分析发现, 大肠杆菌与真核细胞表达的 糖蛋白在寡糖链组成上没有相似性, 但是同样与 AsnXaaSer /Thr 的氨基酸残基结合[23] 。Schultz 等将进化突变的方法应用于蛋白的翻译后加工中, 结果获得了高产率的糖基化的肌红蛋白。他们从甲烷球菌中分离出酪氨酸 tRNA 合酶 TyrRSs基因,在活性位点进行随机突变, 经过几轮阳性和阴性筛选后得到对