磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究Study of immobilization of lipase in magnetic chitosan microspheres纵伟刘艳芳赵光远ZONG Wei LIU Yan-fang ZHAO Guang-yuan（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002）（School of Food and Biological Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou，Henan450002,China）摘要：目的：为制备具有高活性的固定化脂肪酶。
方法：以磁性壳聚糖微为载体，用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定了最优条件，并比较游离酶和固定化酶的pH和热稳定性，研究固定化酶的使用稳定性；结果：固定化的适宜条件为采用加酶量600U/g,温度5℃,pH7.0，固定时间2h。
固定化酶的pH和热稳定性都优于游离酶，固定化酶连续使用5次，其相对酶活仍为使用前的57.8%，具有较好的操作稳定性。
结论：磁性壳聚糖微球是固定脂肪酶的良好载体。
关键词：磁性壳聚糖微球；固定；脂肪酶Abstract：Objective：To produced the immobilized lipase with higher activity; Methods:Lipase(EC3.1.1.3)was immobilized in magnetic chitosan microspheres by physical adsorption．In this article．different factors that influenced the immobilization were investigated，and the optimum conditions were ascertained．Comparative studies of pH and thermal stability between free lipase and immobilized lipase were also conducted;Results:The optimum factors of immobilization were as follows:600U/g lipase was added to the solution at pH7.0,5℃for2h.In comparison with free lipase,the pH and thermal stability of immobilized lipase was increased.To use in hydrolyzation of oil,the immobilized enzyme activity remained activity of 57.8%after5repeated hydrolyzation.Conclusion：Magnetic chitosan microspheres was a kind of good support for immobilized enzyme. Keywords：Magnetic chitosan microspheres；Immobilization；Lipase——————————基金项目：河南省教育厅杰出科研人才创新工程项目（项目编号：2007KYCX0020）作者简介：纵伟（1965-），男，郑州轻工业学院食品与生物工程学院教授、博士。
E-mail:zongwei1965@收稿日期：2007-10-26脂肪酶(EC.3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，脂肪酶能在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、高聚物合成和立体异构拆分等有机合成反应[1～3]。
但游离酶催化，存在酶难以分离，无法重复利用等缺点。
固定化脂肪酶，不仅能保持酶催化高效和专一的特点,而且能大大提高酶的热稳定性和化学稳定性，同时,易于分离,有利于酶的多次重复使用及产品的纯化[4]。
然而，对于非磁性载体固定化酶的应用，存在着必须离心操作，样品不得不稀释及载体回收损失大等问题。
因此，寻求更好的固定化酶载体成了人们研究的热点，用磁性高分子作为酶的固定化载体可以有效地避免以上问题，它可借助外部磁场，简单、方便地回收和磁性导向，因此，近年来磁性高分子载体固定脲酶、糖化酶等的研究已有报道[5，6]，而采用磁性壳聚糖微球固定脂肪酶，还少有报道。
因此，本研究以磁性壳聚糖为载体，采用物理吸附法固定脂肪酶，探讨固定化的工艺条件，并对固定化酶的性质进行研究。
1试验材料与方法1.1材料与仪器壳聚糖：浙江玉环生物制品公司，脱乙酰度85%；脂肪酶：华东理工大学学生物反应器工程国家重点实验室；25%戊二醛：中国医药集团上海化学试剂公司；其他试剂：均为分析纯；数控恒温水浴锅：常州国华仪器有限公司；pH计：上海第二分析仪器厂；751-GD紫外可见光分光光度计：上海分析仪器总厂。
1.2试验方法1.2.1磁性壳聚糖微球的制备将400mL的FeCl 2(0.123mol/L)-Fecl 3(0.103mol/L)混和液与5mol/L的NaoH溶液160mL混合，剧烈搅拌10min，得到磁流体，将2mL磁流体、4%壳聚糖乙酸溶液（3%乙酸溶液配制）20mL、80mL液体石蜡、5mL span-80加入200mL锥形瓶中，于40℃下充分搅拌15min，然后加入4mL 18.5%戊二醛，调pH至9.0，反应2h，分别用异丙醇、乙醚、丙酮和水充分洗涤后，冻干，用磁铁将产物分离，得磁性壳聚糖微球[7]。
1.2.2磁性壳聚糖微球固定化酶的制备将磁性壳聚糖微球加入100mL锥形瓶中，用磷酸缓冲液充分溶涨，取出，同时将脂肪酶溶于pH7.0的磷酸缓冲液100mL，然后将溶涨的磁性壳聚糖微球加入脂肪酶磷酸缓冲溶液中，在恒温摇床上于振荡一定时间，用磁铁将磁性壳聚糖微球沉淀，倾出上清液，用磷酸缓冲液洗至洗出液无紫外吸收，得固定化酶[8]。
1.2.3酶活的测定采用橄榄油乳化法测定脂肪酶的活性[9]。
脂肪酶的活力定义：1min 内催化脂肪水解生成1μmol 脂肪酸所需的酶量定义为1单位酶活力。
1.2.4固定化酶的活力回收率%=100% 固定化酶活力活力回收率（）制备时加入酶的总活力2结果与讨论2.1固定化反应条件的确定分别研究不同酶量、固定温度、固定pH 和固定时间对固定化酶的活力回收率的影响，结果见图1～4。
（温度5℃，pH7.0,时间2h）(加酶量600U/g,pH7.0,时间2h)图1加酶量对活性回收率的影响图2温度对活性回收率的影响（加酶量600U/g,温度5℃,时间2h）（加酶量600U/g,温度5℃,pH7.0）图3pH对活性回收率的影响图4时间对活性回收率的影响从图1～图4可见，加酶量小于600U/g时，随着加酶量增加，固定化酶的活力回收率增加，但大于600U/g后，固定化酶的活力回收率增加缓慢；温度越低，固定化酶的活力回收率越低；pH7.0时，固定化酶的活力回收率最大，过酸过碱条件下，固定化酶的活力回收率都减少；在2h以内，时间增加，固定化酶的活力回收率增加，但大于2h后，固定化酶的活力回收率增加缓慢。
综合以上因素，固定化酶的条件采用加酶量600U/g、温度5℃、pH7.0、固定时间2h。
2.2固定化酶性质的研究2.2.1固定化酶的热稳定性将固定酶和游离酶在pH7.0条件下，置于不同的温度中，30min后分别取固定酶和游离酶测定其活力(图5)。
固定化酶的热稳定性明显高于游离酶。
在40℃处理30min后，固定化酶仍保持54.4%的酶活，而这时游离酶活只有32.9%，可见固定酶具有更好的热稳定性。
这可能是因为固定化后酶分子之间、以及酶与载体分子之间的相互作用使得酶分子结构刚性增强,因而抗拒热变性作用能力增加所致，游离酶由于缺乏这些作用力，较容易因为去折叠而变性。
2.2.2固定化酶的pH稳定性将固定酶和游离酶在20℃条件下，置于不同pH条件下,30min后分别取固定酶和游离酶测定其活力(图6)。
固定化酶的pH稳定性明显高于游离酶。
这是因为在固定化过程中,吸附或交联使酶分子产生多位点固定化,与游离酶相比,固定化酶分子的构象更加稳定,对酸碱的耐受性更强。
图5固定化酶的热稳定性图6固定化酶的热稳定性2.2.3固定化酶的操作稳定性将固定化酶重复用于橄榄油乳化液的水解反应,观察酶活变化，结果见图7,当固定化酶重复使用5次后，其相对酶活仍为未使用时的57.8%，表明固定化酶的操作稳定性较好。
图7固定化酶的操作稳定性3结论吴茜茜等[10]研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化条件，经固定后，酶活力回收率约为54.2%，经过10批次连续水解植物油反应，固定化酶的活力保持在82.6%；陈秀琳[11]采用CM-纤维素固定化脂肪酶，经固定后，酶活力回收率最高为41.8%，经水解橄榄油重复试验发现:其半衰期为225h。
本试验以磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附法固定化的脂肪酶，酶活力回收率最高为43.6%,重复用于橄榄油乳化液的水解反应5次后，其相对酶活仍为未使用时的57.8%,表明其活力回收率和使用稳定性于以上方法相当，但该法固定的脂肪酶，使用磁场回收，回收更方便。
以磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附法固定化脂肪酶，固定化酶的条件为：加酶量600U/g、温度5℃、pH7.0、固定时间2h。
同游离酶相比，固定化脂肪酶pH 稳定性、热稳定性均高于游离酶,表明磁性壳聚糖微球是固定脂肪酶的良好载体。
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