图8 融合蛋白经 PH6.0-7.5,25℃ 处理后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
结果分析 实验结果表明： 1. 通过图1至图5可知，精氨酸激酶N末端 和C末端结构域基因已经位于pET-28a 载体质粒上，等待测序结果，载体的 构建工作已经基本完成。 2. 通过图6测序结果可知，精氨酸激酶N 端结构域载体已确定构建完成。 3. 通过图7至图8可知，虽然获得了N端结 构域，但是浓度较低，需要进一步摸 索条件，以获得浓度较高的N端结构域。 C端结构域载体构建工作还未完成。
1.3 研究意义
蛋白质折叠问题的研究具有重要的生物学意义: 一是可以大大加快对蛋白质空间结构的认识；二是能对恢 复无活性蛋白质的活性起到很好的指导作用；三是能指导 新药物、新蛋白的研制；四是能帮助认识相关疾病的治病 机理，并为寻找有效的治病方法提供理论指导。 精氨酸激酶的折叠机制还尚未完全阐明，本课题通过对精 氨酸激酶两个结构域的折叠机制进行研究，进一步阐明精 氨酸激酶的整个折叠过程，有利于更深刻地掌握精氨酸激 酶结构、性质以及功能之间的相互关系，对了解一般蛋白 质折叠机制具有重要的借鉴意义。
From Genfa Zhou
AK的N端结构域与C端结构域在折叠的过程中的相互 关系到目前还没有明确的论述，两个结构域在各自折 叠时折叠的先后顺序，有无相互作用，以及作用的机 制，是本文的研究目标。
1.2 蛋白质内含子简介 1.2 Ssp DnaB 蛋白质内含子简介
蛋白质内含子(intein)是一类具有自我剪切功能的 多肽，它能将自身从前体蛋白中切出并催化其两 侧的肽链之间形成肽键。 Ssp DnaB是一种小型蛋白质内含子。近年来越来 越多地被应用于多肽融合标签技术以获取小肽药 物（如 人脑纳素、抗病毒多肽、抗肿瘤多肽）。 该方法成本低、效率高，无需采用蛋白水解酶或 化学水解试剂就可得到传统方法难以获得的小型 蛋白质或多肽。
4.后续实验展望
1.优化纯化条件，获取较纯的N-domain和C-domain。 2.研究两个结构域可能的折叠机制，利用内源荧光、 ANS荧光以及紫外差谱等的检测，观察精氨酸激酶N 末端结构域和C末端结构域单独在脲溶液处理下的变 性与复性过程，以及同时变性与复性的过程。 3.提出可能的相互作用的折叠机制。
M 1 2 3
1：质粒pTWIN1 2：质粒pTWIN1经 SapI/PstI 双酶切 3：质粒pTWIN1经 SapI/BamHI 双酶切
1 2 3
图 2 载体质粒pTWIN1经双酶切后的的琼脂糖凝胶电泳
AK-N UP ：GGTGCTCTTCCAACATGGCTGACGCTGCTGTTA SapI AK-N Down：GGTCTGCAGTTAGGTCTGCTTGAAGCCAACATG PstI AK-C UP ：GGTGCTCTTCCAACGACAAGCACCCCAACAA SapI AK-C Down：CGCGGATCCTTACATCTCCTTCTCAATCTTGATG BamHI
Ssp DnaB蛋白介导的精氨酸激酶N末端 和C末端结构域的表达与纯化
主要内容
1. 背景介绍
2. 实验设计思路 3. 实验结果与分析
4. 后续实验展望
1.1 精氨酸激酶简介
From Genfa Zhou
精氨酸激酶（AK）是无脊椎动物能量代谢中的一种重要磷酸激 酶，它能够催化ATP的产生，是由一个小的α-螺旋组成的N端结构 域和一个大的C端结构域组成。C端结构域为8股反平行β-折叠被7 个α-螺旋包绕着。精氨酸激酶的结合部位主要位于C端结构域， 活性催化部位则全部位于C端结构域。
1000bp
500bp
1:载体质粒pET-28a 2:质粒pTWIN1/N-terminus 3:质粒pTWIN1/C-terminus 图4 质粒pET-28a、pTWIN1/N-terminus和 pTWIN1/C-terminus经过NdeI/BamHI双酶切后 的琼脂糖凝胶电泳
M
1
2
3
500bp 300bp
3. 实验结果与分析
AK-N UP ：GGTGCTCTTCCAACATGGCTGACGCTGCTGTTA SapI AK-N Down：GGTCTGCAGTTAGGTCTGCTTGAAGCCAACATG PstI AK-C UP ：GGTGCTCTTCCAACGACAAGCACCCCAACAA SapI AK-C Down：CGCGGATCCTTACATCTCCTTCTCAATCTTGATG BamHI
N端PCR条件： C端PCR条件： 变性：94℃ 变性：94 ℃ 退火：57℃ 退火：60 ℃ 延伸：72℃ 延伸：72 ℃ 循环次数：35 循环次数： 35
900bp 700bp 500bp 300bp
1：以AK基因为模板经PCR扩增得到的N端产物 2：以AK基因为模板经PCR扩增得到的C端产物 3：水对照 图 1 以AK基因为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
LOGO
衷心感谢潘继承老师、汪劲 松老师对本小组的精心指导！ 衷心感谢石玉林师兄对本小 组的大力支持！
2.实验设计思路
由于AK的两个结构域尤其是N端多肽难以用常规的 诱导表达方法得到，并且疏水性较强，因此本课题 采用融合蛋白表达的方法获得目的蛋白，利用蛋白 质内含子自我剪切的特性，可以不借助任何内切酶 而得到AK的N端和C端，进而分别研究N端和C端的 独立折叠以及相互作用的机制。
整 体 思 路 图 解
M
1
2
图5 以质粒pET-28a/N-terminus为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
图6 测序结果
116.0KD
66.2KD
45.0KD 35.0KD
25.0KD
18.4KD 14.4KD
图7 经过Ni亲和层析柱纯化得到的融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
43KD 31KD
Hale Waihona Puke 10KD900bp 700bp 500bp 300bp
1：以 pTWIN1/N-terminus为模板 2：以 pTWIN1/C-terminus为模板 3：水对照
M
1
2
3
图3 以质粒pTWIN1/N-terminus和质粒pTWIN1/C-terminus 为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
8000bp 6000bp 5000bp 3000bp