1，盐析
■ 盐对蛋白质溶解度的影响：
● 盐溶 Salting-in:
加盐使蛋白质溶入水溶液中
● 盐析 Salting-out:
加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來
■ 提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：
溶
pI [NaCl]
解
0.005M
度
0.02M
pH > 5.2
2
0.01M
1
0.001M
pH = 5.2
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
4) 价格便宜。
盐析剂用量的确定
盐浓度的表示法
盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱 和的溶液成为100%饱和度。
影响盐析的因素
蛋白质浓度 离子强度和类型 pH 温度
1、动植物酶、微生物胞内酶的酶液制备流程
收集细胞 细胞破碎 固液分离 酶液浓缩
酶液
一、酶液的制备
2、微生物胞外酶的酶液制备流程
发酵液预处理 固液分离 酶液浓缩 酶液
3、细胞破壁的方法：
● 干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill)
● 湿式： 均质机, 果汁机 (Waring blender), Polytron, 研砵,
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
(NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 70.6 4.9 1.6
20℃ 75.4 18.9 7.8
80℃ 95.3 43.3 93.8
100 ℃ 103 42.2 101
2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
选择中性盐应注意的问题 使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而
本身又易去除。 对酶无毒性，应用不受影响。 价格低廉。 废水处理容易。
常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他 常用盐类相比有十分突出的优点：
1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这 是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是 在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～ 4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度， 远远高于其它盐类：
+
- -+
++
-+- + -+ -
-+
+
-
-+
+
-
-
+
+ +
-3; +
+
-
+--
-
+
-
-+
-
-
+
- +--
+
分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入 盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。
Salting-out:
+ +
+
--
+
NH4
A little salting-in effect
4.8 5.0 5.2 5.4 5.6
pH
0.001
0.01
0.1
NaCl concentration (M)
Salting-in
Salting-in:
NaCl
溶
解
KCl
度
Ionic strength
+
+ +
+
- +-
-
+
+=-
-
+- +
-+
+-
-
-
+=--
-
NaCl
+-
-
- ++
- -+
+
+
+
- -+
温度对盐析的影响
温度升高溶解度的下降现象只有在高离子强度下才能发生。 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度大多数在一定范围内是随着温度增加而增加的。 在一般情况下，蛋白质的盐析温度要求不严格，可以在室温下进行，只有某些对温度比较敏 感的酶，要求在低温0-4 ℃下操作。以避免活力的丧失。
盐 析
定义：在酶或蛋白质溶液中加入 中性盐使其沉淀析出的过程
机理 破坏酶蛋白质分子表面水膜 中和酶蛋白质分子表面电荷
盐析法的优点 • 成本低，不需要什么特别昂贵的设备。 • 操作简单，安全。 • 对许多生物活性物质具有稳定作用。
盐析法的缺点 • 沉淀物中含有大量的盐析剂
盐析用中性盐的选择
常用的中性盐 MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4
蛋白质的浓度与盐析的关系
利用盐析方法分步分离蛋白质各组份和溶液中蛋 白质实际浓度有很大关系。 LogC1＝β-KsI1
这里的I1是蛋白质开始沉淀时的离子强度。 但如 果这种蛋白质在溶液中含量较低(设其浓度为C2)， 则需要加人较多的中性盐，蛋白质才开始沉淀。 (设此时离子强度为I2)应写作： LogC2＝ β-KsI2 Log（C1/C2）＝Ks（I2-I1）
第五章
酶的提取及纯化
酶提取纯化方法
● 1 酶液获得 ● 2 沉淀、萃取方法 ● 3 柱层析分离法 ● 4 电泳
重点掌握：酶液制备的方法、从酶液中提取 酶的方法、酶的制剂化
酶提取纯化总原则
防止酶的变性失活
低温 合适的pH 避免激烈搅拌，减少泡沫 去除重金属、微生物、蛋白酶等
一、酶液的制备
玻璃球 (glass bead), 超声波震荡, French press
一、酶液的制备
4、发酵液的预处理
预处理的目的 改善发酵液的过滤性能，使其更易过滤， 获得澄清的酶液。
预处理的方法 ➢加热 ➢凝聚（Coagulation）和絮凝（Flocculation） ➢助滤剂
一、酶液的制备
5、固液分离 ➢ 过滤 ➢ 离心 ➢ 沉降 ➢ 膜过滤
溶
Ammonium sulfate
解
度
+
-
-
+
SO42-
+ +
+
--
Sodium sulfate
Ionic strength
Aggregate
+
-
- --
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多水分子，当盐类加入时， 这些水分子被抽出，以便盐离子进行水合，暴露出来的疏水性区域 相互结合，形成沉淀。
一、酶液的制备
6，酶液浓缩 酶液浓缩的作用
减少盐析剂、有机溶剂用量 减少压滤后的废水量，从而减轻其对周围环境
的污染
酶液浓缩的方法
真空浓缩（刮板薄膜蒸发器、降膜式蒸发器、 升膜式蒸发器）
冰冻浓缩 超滤浓缩
二、酶的提取
盐析沉淀 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 复合沉淀 双水相萃取 反相胶团萃取
离子强度和类型对盐析的影响
几种蛋白质析出时所需硫酸铵的 离子的强度
蛋白质在不同电解质中的盐析效应
离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响 较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱
pH对盐析的影响
盐析时常选择溶液pH值在该蛋白质等电点附近。 但必须注意在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的。需根 据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处，才能使盐析获得更好效果。