第二十九讲病毒的分离与测定
教学目的：掌握病毒效价的测定方法
教学重点：噬斑法、终点法
教学难点：病毒的分离与鉴定
课时分布：1学时
教学过程：
一、病毒的分离与纯化
1、病毒的分离
病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。
（1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。
（2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。
噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。
2、病毒纯化
通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。
（1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。
（2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。
二、病毒的测定
在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。
发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数
（1）电镜下直接计数
（2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。
此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。
但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。
总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。
2、病毒的感染性测定
测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。
病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。
病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。
（1）噬菌斑的测定
噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。
它是phage存在的一种指示性指标。
在液体培养基中培养物变清。
一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。
通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。
①双层平板法
底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固
指示菌0.2 ml、检样0.1 ml
→32℃16-24h
测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼
脂的上层出现透明无菌的圆形或近圆形的噬菌斑。
该法在phage的检查和定量测定中普遍采用，常用于phage效价测定，效价=平均phage斑数×稀释倍数÷取样液量
②单层平板法
用无菌吸管各吸取指示菌、检样于灭菌培养皿中，将冷到45℃的单层培养基倒平皿，并与指示菌、检样混匀，32℃、12小时观察，也可直接将三种混合再倒平皿。
指示菌混匀32℃12h观察
检样0.1ml
该法简便、省料，但难以准确定量。
③平板点滴法
单层培养基15ml 培养3-4h长出菌落点滴 32℃6-8h 观察溶菌斑
指示菌0.2 ml
接种环沾取检样分别点菌落，有phage则会使所点菌落溶解。
该法简单、快速，可初步判断待测试样的效价。
④平板交叉划线法
检样
噬菌斑
指示菌
若有phage存在，则会在交叉处出现噬菌斑。
动物病毒的噬斑测定与噬菌体的噬菌斑测定类似，所不同的是以单层细胞代
替细菌。
植物病毒采用枯斑测定即用金刚砂破坏植物表皮与细胞壁并与一定量的植物病毒混合摩擦植物叶片进行接种，一产生坏死斑的数目来测定病毒样品的效价。
（2）终点法
不能用噬斑法或坏死法测定的动、植物病毒可用该法定量。
方法是取等体积的经10倍或2倍稀释的病毒系列稀释液分别接种同样的实验单元（如某种动、植物、鸡胚或细胞培养）经一定时间，以实验单元群体中的半数（50%）个体出现某一感染反应所需的病毒剂量来确定病毒样品的效价称半数效应剂量，并以实验单元群体中的半数（50%）个体出现某一感染反应的病毒稀释液的稀释度的倒数的对数值表示。
半数效应剂量有不同的表示：半数致死剂量指使半数试验宿主死亡的病毒剂量；半数感染剂量指使半数试验宿主发生感染的病毒剂量；半数组织培养感染剂量指使半数组织培养物遭受感染发生细胞病变的病毒剂量。
三、病毒的鉴定
1、根据病毒感染的宿主范围及感染表现鉴定
2、根据病毒的理化性质鉴定
3、血细胞凝集性质鉴定许多病毒能吸附于一定种类动物的红血球细胞表面产生凝集现象。
不同病毒所凝集的血细胞种类、凝集温度、pH不同。
4、血清学鉴定
5、分子生物学学方法
3、毒粒的性质。