粪大肠菌群的测定（多管发酵法）
一、检测限
二、试剂(均为分析纯)
1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液（1份量）(因有固体培养基，以下配置方法仅做参考)
单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1mL）：称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶，用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL，摇匀备用。

（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫）
碳酸钠（10.6g）：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。

（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠）
将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。

(>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小试管(12x150mm ）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）、高压蒸汽灭菌器、试管架（10只入）、纱布和棉花)
2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液：制法同上，除蒸馏水外，其余配方比例三倍。

3、EC培养液（1份量）
将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g，加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。

用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。

再将分装试管置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。

灭菌后pH应为6.9。

（>1L烧杯1只）
在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。

当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。

三、耗材和仪器
1、仪器：高压蒸汽灭菌器、生化培养箱（恒温箱）（25-44℃）、无菌操作台、天平
2耗材：倒置的小玻璃管的试管70套（小试管(12x150mm）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）；与小试管配套的棉塞或纱布和棉花；药匙、电炉、3mm接种环3根、吸耳球、牛皮纸、酒精灯1个、火柴、镊子2个、笔、试管架、滤纸（1盒）、、1mL及10mL移液管各2支
三、实验步骤
1、水样接种量
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。

每个样品至少用三个不同的水样量接种。

同一接种水样量要有五管（平行）。

（如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1ml或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中）
2、初发酵试验
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管（含有玻璃倒管的试管）中（取原水样1mL，加如到9mL无菌生理盐水中混匀。

这时候得到的稀释液1mL就相当与0.1mL，
再按这个方法再稀释一次，就可以得到1mL相当于0.01ml的稀释液了。

这时候取1mL加入发酵管中即可）。

在37℃±0.5℃下培养24h±2h（箱内温度一定要达到所要求的温度(37.5±0.5℃)时，方可放入，下同）。

产酸和产气的发酵管表明试验阳性。

（培养液中加入溴甲酚紫作为酸度指示剂，细菌产酸后，培养液即由原来的紫色变成黄色。

）产酸产气的发酵管表明试验阳性。

如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。

（需20支同规格试管）
3、复发酵试验
轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒(2-3环)将培养物转接到EC培养液中。

在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面，提高培养温度可造成不利于来自自然环境的大肠菌群的生长）。

接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。

培养后立即观察，发酵管产气则证实为菌群阳性。

记录：复发酵阳性管数
Ps:接种过程（亦有参考视频可供学习）
①接种前的准备工作。

a．检查接种工具，进行环境消毒。

b．在欲接种的培养基试管上贴好标签，标上接种的菌名、操作者、接种日期等。

c．将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。

②接种方法
接种方法：斜面接种
将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。

置试管口于酒精火焰附近。

将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管内，在管壁上停留片刻待其冷却。

取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。

取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。

重新塞上棉塞。

烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。

4、计算（参考HJ/T 347-2007）
其他问题：
1、样品的保存：采样用的容器使用前应盖好瓶盖，用牛皮纸将瓶盖和瓶颈处包裹好，置干燥箱160℃-170℃干热灭菌2h，或用高压蒸汽灭菌器121℃灭菌15min。

采样后水样的正确保存也很重要，如保存不当可使样品中的大肠菌群细菌死亡或在一定条件下再生长，这些都将影响检测结果的准确性。

检测室接到水样后，应立即检测，如因故不能检测时，应立即将样品置于冰箱内(2℃-10℃)并于2小时内检测。

2、多管发酵法所用的发酵管、小玻璃倒管和塑料盖可在清洗、高压灭菌和紫外线消毒后重复使用。