《下呼吸道细菌学检验操作规 范（讨论稿）》
钟 桥 苏州市立医院本部
前言
• • • • • 口咽部正常菌群 常见的肺部感染机制： 吸入性：定植菌吸入肺部 呼入性：呼吸机、气溶胶等 血播性：见于静脉吸毒或血透患者
分析前下呼吸道标本检验
• 标本采集 咳痰 诱导痰（高渗盐水诱导3%NaCl 20-30ml）
• Murray, .R.,Baron ,E.J.,Pfaller ,M.,Tenover, F.,and Yoken, R. 2006. Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. ASM Press, Washinton,D.C.
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气管和内镜吸出物 （气管插管24h，就有定植菌，仅有临床 症状时，否则切勿培养气管吸出物） 气管镜标本 （由肺科医生或受训后医生采集）支气管 肺泡灌洗液（BAL）支气管灌洗液，保护 性毛刷标本（PSB），支气管穿刺活检标 本 支气管灌洗液-BAL-PSB-穿刺活检标本
标本运送
无菌杯 条码 1－2h内送检 超时，苛养菌如肺炎链球菌减少，口咽部 正常菌群将过度生长
培养 35－37℃、5%CO2条件培养48h，最好至72h； 侵入性方法采集的肺标本，培养延长至4天
直接试验
革兰染色
注明细胞、细菌量以及评价结果 见表3 胆汁溶菌试验 革兰阳性双球菌
表3 痰涂片革兰染色结果解释
指征
每个低倍镜视野发现>10个鳞状上皮 细胞
解释
标本含有唾液和上呼吸道分泌物，报告 “>10个扁平上皮细胞/低倍视野，提示 标本被唾液污染，将不再进行培养”
污染痰标本和气管内标本革兰染色拒收条件的评价
（痰涂片 20－40/LP；气管吸出物低倍镜和油镜下都要检测）
• 不合格标本有： 痰标本 = 10个上皮细胞/低倍视野 但如果WBC数是上皮细胞数的10倍，单一形态的 细菌量达到3+至4+，可接受标本进行培养 成年人支气管吸出物：10SECs/LPF或未见细菌 患儿支气管吸出物：未见细菌 如WBC 4+，并可见纤维细胞，但未见细菌，最 好重新涂片做吖啶橙染色，用荧光显微镜观察弹 性纤维上是否有细菌，假单胞菌和嗜血杆菌可能 会在这类涂片中漏检； 还可以见军团菌，此类感染中常缺少白细胞。
不要报告小菌落的beta-溶血链球菌或F群链球菌，
因为这些菌是上呼吸道正常菌群
链球菌 Alpha-溶血链球菌 Optochin敏感实验 胆汁溶菌实验 （联合上述两个实验进行鉴定） 药敏实验，贴OP纸片确认纯度以检查药敏结果是否
有污染
苛养革兰阴性杆菌 流感嗜血杆菌，卫星现象，ALA实验确认鉴定并 作beta-内酰胺酶试验。 百日咳博德特菌 触酶和尿素酶阳性，培养48h出 现肉眼可见菌落 巴斯德菌 吲哚和氧化酶阳性，动物口腔正常菌群
囊性纤维化患者标本有特殊要求
囊性纤维化患者标本操作规范
菌名
丝状真菌 肠杆菌科 金黄色葡萄球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 铜绿假单胞菌，洋葱克 雷伯，其他非发酵菌
鉴定
任何数量 优势菌 任何数量 优势菌 优势菌 任何数量
特殊处理
鉴定到种水平 做药敏实验 做药敏实验，做苯唑西林筛选 做beta-内酰胺实验 用苯唑西林纸片做青霉素耐药 筛，主要见革兰阳性 可疑肺炎链球菌。电话通知临床医生 球菌成对或成短链排列
指征
大量多形核白细胞，主要见革兰阳 性球菌成堆排列 大量多形核白细胞，主要见革兰阴 性双球菌 大量多形核白细胞，主要见小的革 兰阴性球杆菌 大量多形核白细胞，主要见大而胖 的革兰阴性杆菌 大量多形核白细胞，大量小的革兰 阴性杆菌，球杆菌，革兰阳性球菌 成链排列以及其他不同形态的细菌
报告“肠道革兰阴性杆菌”
报告“非发酵革兰阴性杆菌”
报告“分离到上呼吸道细菌”， 注如果只存在肠球菌和凝固酶阴 性葡萄球菌（有或没有酵母菌）， 报告“混合有革兰阳性微生物细 菌，或如果90%是培养物，则做 少量鉴定列出”
草链和或非致病的奈瑟菌，类白喉菌、凝 固酶阴性葡萄球菌、Rothia罗思氏菌、F群 链球菌，厌氧菌，嗜血杆菌属（非流感）， 艾肯菌，放线杆菌嗜二氧化碳菌，莫拉菌， 肠球菌，酵母菌和有意义数量的金黄色葡 萄球菌，革兰阴性杆菌和脑膜炎奈瑟菌
当培养少量，涂片也见到时报告
当培养达到有意义数量时，即使不 卡他莫拉菌 是优势菌，也报告 脑膜炎奈瑟菌 只对住院患者报告： 铜绿假单胞菌，报告药敏 嗜麦芽窄食单胞菌 不动杆菌，报告药敏 伯克霍德菌，报告药敏
检测
当培养达到有意义数量，并且是 优势菌，特别是涂片提示多形核 白细胞与培养一致，报告
病原菌
快速生长分枝杆菌
任何数量
鉴定到种水平
葡萄球菌 痰涂片显示有优势的呈堆球菌并与白细胞相关， 没有其他致病菌时，鉴定有意义菌量的金黄色葡萄 球菌 住院患者，鉴定并作苯唑西林耐药 仅当菌量达到90%纯培养时，鉴定凝固酶阴性葡
萄球菌，无需鉴定到种水平，无需做药敏
肠球菌 不要报告肠球菌，除非达到90%纯培养 很多革兰阳性球菌都是呼吸道正常菌群
• 门诊接受到大量脓性标本，应立即接种，不必等 待涂片结果。 • 拒收培养标本报告方式： • “涂片所见：每低倍镜视野含＝10个扁平上皮细 胞，提示标本质量差，不做培养；如果有临床指 征请重新采集标本” • “涂片检查40个视野，未见细菌，不做培养；如 果临床指征请与实验室联系” • 不能拒收标本 • 送检军团菌培养、抗酸染色痰标本、气管吸出物 和来自囊性纤维化患者的痰标本
每低倍镜视野发现<10个扁平上皮细 提示是一个良好的深部痰标本 胞，大量多形核白细胞，存在肺泡巨 噬细胞和柱状上皮细胞
大量多形核白细胞 胞内细菌 弹性蛋白或胶原纤维
Curschmann’s螺旋纤维
提示感染
提示感染
淀粉样小体 坏死白细胞
粉色絮状物 Charcot-Leyden结晶
提示感染
提示呼吸道疾病治疗产生的雾状高渗水 提示过敏性肺曲霉病
霉菌 念珠菌不能引起肺炎，除非肿瘤患者、肺移植患 者或新生儿。酵母菌是口腔正常菌群。
如果涂片时见到细菌但培养不生长，扩大培
养，可能存在军团菌、百日咳博德特菌和分
枝杆菌。
表4 下呼吸道培养致病菌报告指南
表6 常见可疑菌落形态及快速经典方法初步鉴定
检测
检验并报告
病原菌
化脓链球菌 B群beta-溶血链球菌（儿童） 博德特菌属，特别是支气管博德特菌 奴卡菌 新型隐球菌 淋病奈瑟菌 弗朗西斯吐拉菌（高致病菌） 鼠疫耶尔森菌（高致病菌） 炭疽芽孢杆菌（高致病菌） 霉菌，排除腐生菌污染 肺炎链球菌，报告药敏 流感嗜血杆菌，报告beta-内酰胺酶
解释
可疑金黄色葡萄球菌。电话通知临床 医生 可疑卡他莫拉局限性肺炎菌。电话通 知临床医生 可疑流感嗜血杆菌。电话通知临床医 生 可疑克雷伯菌或其他肠杆菌科菌引起 的肺炎 提示吸入性肺炎。这需要在报告中特 别提示，因为培养结果会显示正常菌 丛生长。电话通知临床医生
出芽酵母样孢子和假菌丝
通常提示鹅口疮或上呼吸道酵母菌感 染，不是肺炎，仅当其为主要所见菌 时报告
请高级医师进行确认，可能需要补充 实验如改良的抗酸染色
其他异常结构，如真菌，分枝的革 兰阳性丝状杆菌或奇特形状的细菌 （可能抗生素治疗的结果）
培养结果检查
观察24h后平板
继续培养平板24－48h，为检出霉菌、慢生长菌、 苛养的革兰阴性杆菌如博德特菌属
革兰染色结果解释培养结果 炎性细胞和细菌来决定对培养物下一步处理 如培养与涂片不符，重新读片 按照表4报告 鉴定以下有临床意义的可疑致病菌，排除正常 菌群
金黄色葡萄球菌，报告药敏 B群beta-溶血链球菌（成人），C、G群 单一形态革兰阴性杆菌（肺克）报告药敏 苛养革兰阴性杆菌，报告beta-内酰胺酶 尿素阳性棒状杆菌或来自ICU 来自免疫抑制患者，马红球菌 在麦康凯平板上生长1种以上革兰阴性杆 菌，氧化酶阴性，吲哚阳性，乳糖阳性或 蔓延生长 在麦康凯平板上生长1种以上革兰阴性杆 菌，氧化酶阳性，三糖铁上不发酵葡萄糖
革兰阳性杆菌 排除任何数量来自免疫抑制患者的奴卡菌和马红 球菌（粘液样并尿素酶阳性）
马、猪等动物致病菌，可条件致病，可以导致免疫抑制 患者的肺炎
大芽孢革兰阳性菌，则需排除炭疽芽孢杆菌和腊 样芽孢杆菌
快速尿素酶阳性（假白喉棒状杆菌），或标本来
自ICU插管患者时，鉴定大量优势的棒状杆菌
其他革兰阳性杆菌不会引起肺炎，无需鉴定
常见呼吸道重要致病菌
链球菌
苛养革兰阴性菌
革兰阴性双球菌 革兰阴性杆菌 葡萄球菌 革兰阳性杆菌
链球菌 Beta-溶血、触酶阴性呈链状或成对排列的球菌 化脓链球菌（PYR+）任何数量都要报告 患儿标本检查有小溶血环并鉴定B群-溶血链球 菌，任何数量都要报告 优势菌时，有意义数量的Beta-溶血链球菌
标本拒收规则
• 不接受48h内重复送检培养的标本 • 拒收以下标本申请做下呼吸道感染诊断：
24h内采集的痰标本 咽部标本 口水 诱导痰 鼻冲洗液和分泌物 或鼻孔拭子 厌氧培养标本 支气管刷培养，只能 用保护性毛刷 支气管灌洗液，气道 分泌物。
• 标本延迟>2h且未冷藏，应报告中注明标本延误送 检，可能对培养结果造成影响
侵蚀艾肯菌 上呼吸道正常菌群，无需鉴定
革兰阴性双球菌 卡他莫拉菌 G-双球菌，氧化酶阳性，血平板上可推动，丁 酸盐试验阳性 淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌？ 需检验并报告，不需做药敏试验
当培养达到有意义数量时，即使不是优势菌，
也报告（表4）
在麦康凯或伊红美兰平板生长良好的革兰阴性杆菌 革兰阴性杆菌 鉴定和药敏试验 对于住院患者，不管是否有其他病原菌，检查有意 义数量的铜绿假单胞菌、不动杆菌、博克霍尔德菌 和嗜麦芽菌