载体的分类
按功能分类 克隆载体 表达载体 整合载体
克隆一个基因或DNA片断 用于一个基因的蛋白表达 把一个基因插入到染色体组中
按来源分类 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体
第一节 克隆载体
➢质粒载体 ➢噬菌体载体 ➢噬菌体-质粒杂合载体 ➢人工染色体
一、质粒载体
1.质粒的概念
质粒（plasmid)是一种存在于细菌或 真菌染色体外的小型环状双链DNA 分 子，可自我复制和表达。
helper plasmid
mob mRNA Mob protein
recipient cell
部分质粒虽不含tra基因，但含bom位点，当宿主细胞内同时存在
含mob基因的辅助质粒时，mob基因的产物可打开非接合质粒的
bom位点(oriT位点)，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质 粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。
2. 克隆载体应具备的条件。 3. 质粒的基本性质。 4. 标记基因的分类及其作用。 5. 原核表达载体的表达元件，有哪几种表达方式。
基因工程流程图
遗传物质 + 载体 重组的DNA分子 引入细胞或生物体内 复制与表达 稳定地遗传给下代
载体的概念
1）独立的一个基因或DNA片段，不 能自我复制，一般不可以进入受体 细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不 容易在受体细胞内维持。 基因工程载体（vector）：能够把外 Cell propagation 源DNA片段带入受体细胞并进行稳 定遗传的DNA或RNA分子。
3. 生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如 LacZ
并不是寄主生长所必需的，但可以赋 予寄主某些抵御外界环境因素不利影响 的能力（带有抗性基因等） 。
分子量在1-200kb之间 。
大肠杆菌的质粒
一、 质粒载体
2.质粒的空间构型 ①共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA，
cccDNA) 呈超螺旋（SC）（super coil）
一、 质粒载体
标记基因的种类 1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr
2. 营养缺陷标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这 类基因在酵母转化中使用最频繁，如LEU2，HIS4等。
具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相 同的复制子。
以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
一、 质粒载体
c. 质粒的可转移性
接合型质粒(含tra基因) 能在天然条件下自发地从一个细胞转移 到另一个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随
一、 质粒载体
a. 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据 在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个) 和松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个拷 贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一、 质粒载体
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，LDNA）
一、 质粒载体
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
OC L
SC
一、 质粒载体
3. 质粒的基本特性 ➢ 质粒的自主复制性 ➢ 质粒的不相容性 ➢ 质粒的可转移性 ➢ 携带特殊的遗传标记
Transformation of bacterial host cell
Recombinant vector
载体的功能
载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体的要求
A、复制起点：能在受体中复制； B、筛选标记； C、限制性内切酶切割位点； D、外源基因的表达：启动子。 E、载体的大小：原则上要求载体越小越好； F、适当的拷贝数； G、载体的安全性：质粒不能随便转移;
DNA重组技术的基本工具
基因的剪刀（分子手术刀） ——限制性核酸内切酶
基因的针线（分子缝合针） ——DNA连接酶
基因的运输工具（分子运输车） ——载体
第三章 基因工程载体
第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 其它特殊用途载体
本章重点掌握的内容
1. 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质 粒、α-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。
质粒 pBR322 及其衍生质粒 pUC 系列质粒及其衍生质粒 pSC101 及其衍生质粒 ColE1
复制子 pMB1 突变的 pMB1 pSC101 ColE1
拷贝数 15～20 500～700 ～5 15～20
一、质粒载体
b. 质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性) 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。
其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程 的安全要求
非接合型质粒(不含tra基因) 不能在天然条件下独立地发生接合 作用。
用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒 。
一、 质粒载体
质rom conjugative plasmid
bom site Mob gene
一、 质粒载体
d. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基
因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如： 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 标记基因的作用
1.指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子 2.指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞