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蛋白质分子是含有酸性基团和碱性基团的两性电解质，在等电点 时，蛋白质分子的酸性基团和碱性基团的解离度相等，成为带有 正负电荷相等的两性离子，在电场中不向两极移动，并且极易沉 淀。氨基酸组成不同的蛋白质，具有不同的等电点。根据在一定 条件下（如PH，离子强度等）它们所带电荷的数量和种类，分 子的大小及形状等方面的差异，可以采用电泳，离子交换柱层析 等方法对它们进行分离分析。
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4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠 （NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g， 蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分 混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g， 蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量 的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色并 中保存，可使用多年。
许多物理化学因素可以改变蛋白质在水中的溶解度，产生可逆或 不可逆沉淀，这些因素（如增加溶液的离子强度，降低溶液的介 电常数，调节溶液的PH等）以及一些沉淀剂和胶附剂也常用来 分离，提纯蛋白质或除去蛋白质。为了更好地使同学们运用和掌 握好理论和实践相结合，把学到的理论应用到实验中，本系列实 验安排是从一种生物中提取蛋白质，通过各种物理化学性质使其 得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。
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试剂和器材
1、材料： 本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测 定范围。
2、试剂： （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 （2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 称0保.2存取5可g0C用.u5一SgO个酒4月；石。以酸上钾两溶钠液溶混于合8定0容m到lH520O0中m，l，再冰箱加
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蛋白质产物重量
蛋白质产率=
×100%
原料总重量
思考题
1、用丙酮沉淀蛋白时，为何要调PH4.5~5.0？
2、大豆中哪类蛋白含量最多？
Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分
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Folin酚法测定蛋白质含量
目的要求
掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法实验原理 蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收， 折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应， Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin酚法是 一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂 而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。 Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试 剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷 钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨 兰混合物）。
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试剂和器材
1、试剂 （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH （3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL （5） 1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH
2、器材 （1）离心机 （2）烧杯 （3）滴管 （4）PH试纸等
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操作方法
1、水抽提 将豆粉5g用约40毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅 拌 ， 常 温 下 搅 拌 抽 提 1 5 min， 3800r/min 离 心 15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。 取上清液1毫升稀释50倍留做蛋白测定。 其余清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少 量多次慢慢滴加（搅拌）6mol/L和1 mol/L HCL， 调 PH4.5~5.0，3800r/min， 离 心 1 5 min， 收 集 沉 淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，得到粉末状蛋白 质干粉，称重，计算粗产率。
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由于蛋白质中含有带酚基的酷氨酸还原呈兰色，溶液 兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用 Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样 品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的 浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。 Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个， 只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温 时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的， 灵敏度较高的操作方法。
上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右， 几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为 应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为 0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称 之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚 酞 为 指 示 剂 ， 用 Folin 试 剂 乙 去 滴 定 1 mol/L 左 右 的 标 准 NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿 既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙，终点不太好掌握， 溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。
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蛋白质性质与应用技性
低 层 析
亲 水 性
酸 碱
酶
极性
蛋白质
电荷
分 形子 状量
离子交换层析 电泳
离 心
凝 胶 层
析
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一、大豆蛋白的提取
目的要求
1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、计算粗提产率 2、学习计算蛋白质收率
实验原理
大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶 蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂 提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验 主要是水溶提取大豆蛋白。 称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。
大豆蛋白的提取与含量测定
指导老师 徐文俊
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序言
蛋白质化学实验
蛋白质是一切生物体内重要的组成成份，蛋白质是由 二十多种氨基酸以肽键相互联接而成的复杂的高分子 化合物，溶于水时形成亲水胶体溶液。在酸碱和酶的 作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。 蛋白质分子依靠氢键、盐键等副价键维持一定的空间 构型。在各种物理化学因素影响下，由于副价键的破 裂，使其空间结构遭受不同程度的破坏，蛋白质的物 理化学性质和生物学活性也随着改变。该现象称为蛋 白质的变性。