要充足氧的供应，保证更多的NADH2通过侧性呼吸链将H2交
给O2生成CO2和H2O，使呼吸产生的ATP减少，解除ATP对PFK酶 的反馈抑制，使EMP途径代谢流增大，丙酮酸和草酰乙酸生
成水平提高，柠檬酸产率提高。
G
G-6-P
(磷酸果糖激酶)
柠檬酸
I ,NH4 A
+
1.6－二磷酸果糖
丙酮酸

(丙酮酸羧化酶)
白、核酸和脂肪含量明显减少，而氨基酸和铵离子水
平升高（解除柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制），丙酮酸 和草酰乙酸水平升高，柠檬酸大量积累。
4、氧对柠檬酸积累的调节
黑曲霉中除具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链
。标准呼吸链氧化时产生ATP，反馈抑制PFK酶，侧系呼吸链 不产生ATP。缺氧时，侧系呼吸链失活，导致柠檬酸产量急 剧下降。因此，在柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定
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二、国人的节奏—后来居上
1968年：上海酵母厂以淀粉为原料深层发酵工业化产生柠檬酸；同时，适用于 多种不同培养基质（淀粉、木薯、糖蜜等）的菌株不断的被选育出来； 1995年：开发了利用玉米渣发酵柠檬酸的新工艺； 我国柠檬酸发酵技术处于世界领先水平。如安徽丰原生化公司，柠檬酸生产能 力达18万吨，居世界第一位，占世界柠檬酸生产额的17%。另外，山东柠檬酸生 化有限公司的生产规模也是相当的大。目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年 产能力约100万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国，近两年，出口量更是 超过国内总产量的90%，出口依赖严重。出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重 超过60%。2006年柠檬产量达到66万吨，出口60万吨；2007年，国内柠檬酸及 柠檬酸产量76万吨，共出口70.83万吨，2006年和2007年两年国内柠檬酸出口超 过总产量的90%，出口依赖严重。全球柠檬酸的年需求量约为130万吨左右，且 以年5%-7%的速度递增。2007年，全球柠檬酸需求继续以3%的幅度增长。随着 中国人民生活水平的提高，也带动了柠檬酸国内需求的大幅度增加。
koji process
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第三节 柠檬酸的生产菌种
strain
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淀粉质原料或糖质原料：
黑曲霉（ Aspergillus niger ）
正烷烃为原料： 解脂假丝酵母（ Candida lipolytica ） 热带假丝酵母（ C. tropicalis ）
1、黑曲霉的筛选与分离 2、黑曲霉高产菌株的生理特征
四、柠檬酸酯
1、柠檬酸三甲酯和柠檬酸三乙酯 柠檬酸三甲酯是柠檬酸和甲醇酯化而成，无色结晶，易溶于醚和 醇，微溶于水。是一种化工原料，比如可做彩焰蜡烛的主燃剂，它的 熔点和可燃性能完全满足蜡烛制品的要求；还用于医药和农药合成方 面，它是一种性能稳定的中间体；还是柠嗪酸生产的主要原料。 柠檬酸三乙酯由柠檬酸和乙醇酯化而成，无色透明液体，微具 气味，可作为纤维素树脂和乙烯基树脂的增塑剂，且具有抗霉特性。 2、柠檬酸和脂肪酸甘油酯 由柠檬酸酐与单双甘油酯反应生成。为白色至黄色蜡状固体或质 软半固体。有香气，味温和，不溶于冷水，能分散于热水，易溶于乙 醇，用作乳化剂和金属螯合剂，在人造奶油中用量为10g/kg。
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第四节 柠檬酸发酵机理
自20世纪30年代 。。。。。。 目前还没有一种理论能 够解释柠檬酸发酵工艺中 的所有现象
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代 谢 途 径
代 谢 途 径
糖酵解（glycolysis）
乙酰CoA 草酰乙酸
乙酸
苹果酸 乙酰CoA 乙醛酸 延胡索酸
柠檬酸
乙酸
异柠檬酸
琥珀酸
乙醛酸循环）
（一） 柠檬酸生物合成的代谢调节
PFK——磷酸果糖激酶
1——丙酮酸脱氢酶 2——柠檬酸合成酶 3——乌头酸水合酶
4——异柠檬酸脱氢酶
8——琥珀酸脱氢酶
＋ 激活
－ 抑制
1—磷酸果糖激酶 2—丙酮酸脱氢酶 3—柠檬酸合成酶 4—乌头酸水合酶 5—异柠檬酸脱氢酶 6—-酮戊二酸脱氢酶 7—琥珀酸脱氢酶 8—富马酸酶
柠檬酸生成并积累条件下，提供草酰乙酸的途径：
Ⅰ. PEP＋CO2＋ADP Ⅱ. PYR＋CO2＋ATP Mg2+，K+ 生物素 草酰乙酸＋ADP＋Pi 草酰乙酸＋ATP
二、柠檬酸发酵代谢调控
按照正常的菌体的代谢规律，上述 途径并不能够积累柠檬酸，而是进 入TCA循环，被彻底氧化。
问题
• •
柠檬酸的生物合成途径是如何反馈调 节的，同时最终是如何解除的？ 柠檬酸积累的机制是什么？
总结（柠檬酸合成的三个主要控制点）
（1）EMP畅通无阻 ：控制Mn2+ ，提高NH4+ ，解除
二、用途
1、在食品和饮料工业中（75%） 酸味剂、蔗糖转化剂、稳定色素、面制品改良剂、抗 氧化剂、稳定剂、增香剂等 2、在药物中的应用（10%） 泡腾剂、抗凝剂、抗氧化剂 3、其它行业（15%） 金属净化、去垢剂、电镀
三、柠檬酸盐
1、柠檬酸钙 在柠檬酸的工业化生产中，一般是先制成柠檬酸钙沉淀 ，然后再用硫酸溶解得到柠檬酸。柠檬酸钙盐有三种类型：柠檬酸一 钙、柠檬酸二钙和柠檬酸三钙，工业生产中的柠檬酸钙系指柠檬酸三 钙，为白色晶体或粉末。在食品工业中用作鳌和剂、缓冲剂、组织凝 固剂以及钙质强化剂。 2、柠檬酸钠 抗凝血剂，它能螯合凝血所需要的Ca2+离子，广泛用于 输血、血液和血浆保存以及人造代血浆；用于食品中作为风味剂和 pH 缓冲剂；磷酸盐（三聚磷酸钠）的代用品。 3、柠檬酸钾 在体内代谢生成醋酸钾，自肾脏而排出体外，从而可以 增加血液和尿的碱度，用于治疗膀胱炎和糖尿病所导致的酸中毒，它 也是一种补钾剂。 4、柠檬酸锰 缺锰病人的营养剂和收敛剂。 5、柠檬酸铜 工业分析用试剂，医药上用作消毒杀菌剂兼有收敛作用 ，用于配制眼药膏治疗结膜炎、沙眼等。
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三、存在问题—发展中的代价
1、原料上涨、竞争加剧，柠檬酸出口价格竞争优势弱化 2、企业规模普遍较小，抗风险能力弱 3、产能过剩的风险 4、反倾销调查是中国柠檬酸出口的最大障碍
5、人民币持续升值，出口企业损失较大
6、产业政策风险加剧
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四、柠檬酸的研究现状—创新才是主题
高年发，杨枫
工业微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院 中国酿造 2010
我国柠檬酸发酵工业的创新与发展
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第二节 柠檬酸性质及用途
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一、性质
柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗粒或白色结晶性粉末，无臭、味极 酸，易溶于水和乙醇，水溶液显酸性。柠檬酸结晶形态因结晶条件不 同而不同，商品柠檬酸通常有无水柠檬酸和一水柠檬酸。 柠檬酸在水中的溶解度为147g（20℃），在干燥空气中易风化；柠 檬酸易溶于水和乙醇，微溶于乙醚，不溶于苯、甲苯、二硫化碳、四 氯化碳和脂肪酸中。 柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离。加热易分解产生多 种产物。由于柠檬酸含有羟基和羧基，因此既可以同酸发生反应，又 可以同碱发生反应，还可以与醇类发生酯化应。比如：柠檬酸与发烟 硫酸混合，常温下即可脱水生成乌头酸，与硝酸作用可生成硝酸酯； 柠檬酸可与各种碱发生中和反应生成各种盐； 柠檬酸与甘油混合共热可得到柠檬酸甘油酯； 由于含有OH，可被各种氧化剂，如KMnO4氧化。
（4）α-酮戊二酸脱氢酶受到葡萄糖和铵离子阻遏，减弱了TCA
循环，降低细胞内ATP浓度，并使-酮戊二酸脱氢酶浓度升高， 又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解。
（5）顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸
=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向合成柠檬酸， 一旦柠檬酸的浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活性， 从而进一步促进柠檬酸自身积累，pH降至2.0以下，顺乌头酸水 合酶和异柠檬酸脱氢酶活性失活，更有利于柠檬酸积累并排除体 外。
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有机酸 发酵 工艺学
李松
安徽工程大学生化学院 生物工程教研室
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第二章 柠檬酸
citric acid
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第一节 柠檬酸发酵史
lemon
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一、Lemon—to—Citric acid—世界的节奏
1784年：瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶出固体柠檬酸； 1891年：德国微生物学家Wehmer发现一种青霉能产柠檬酸，并开始试生产， 但到1903年停止。主要原因是：难以获得适当菌种；菌种易退化；易污染杂菌。 到20世纪初，柠檬酸绝大部分都是从柠檬汁中提取出来的，主要产地是意大利 的柑橘产业； 1913年：Zahorski首先利用黑曲霉生产柠檬酸；但直到此时并未利用微生物 开始大量生产柠檬酸；直到第一次世界大战开始后（1914年8月~1918年11月）， 由于意大利的柑橘产业受到了破坏，人们才开始用微生物生产柠檬酸； 1916年：美国食品化学家James Currie对黑曲霉属的许多菌株进行普查，发 现很多菌种能产生柠檬酸； 1919年：比利时一家工厂成功地进行了浅盘发酵法生产柠檬酸； 1923年：美国Pfizer公司开始采用黑曲霉浅盘发酵法工业化生产柠檬酸； 1952年：美国Miles/Bayer公司首先成功地采用深层发酵法工业化规模生产柠 檬酸。由于这种新工业比传统的浅盘工艺有更多的优越性，因而推动了世界柠 檬酸发酵工业的迅速发展。
五、柠檬酸的生产方法
1、从柠檬汁中提取 2、化学合成法
3、微生物发酵法
六、柠檬酸的生产工艺
1、表面培养工艺
surface method
23、连续和固定化工艺
continuous and immobilized process
4、酒曲工艺