• b. 常用的分离方法
• 1. 双抗体法
– 特点： 分离完全，非特异结 合小，环境影响小， 效价高，但分离时间 长，成本高。
• 2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000）
– 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大
• 3. 双抗体PEG法
– 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。
– 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间 长和沉淀法非特异性结合高的缺点。
• b. 抗血清的制备：
• 1.大分子物质可直接免疫动物诱导抗体产生，但 是小分子物质为半抗原，必须与载体结合制成人 工抗原（半抗原-蛋白质），才能进行免疫。 • 2．选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊。 • 3．应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛 脂、石蜡油 +卡介苗）。 • 4．选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股 沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加 强）与次数。
放免分析的优点
• 灵敏度高
• 特异性强
• 精确度高
• 用血量少
• 缺点：污染；放射性核素衰变及不 稳定
第三章 放射免疫分析
放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用
免疫放射分析法 （immunoradiometric assay， IRMA）
• 1968年，Miles和Hales创立了免疫放射分析法 （IRMA）。 • IRMA与IRA不同，它是将放射性核素标记在抗体 上，而不是标记在抗原上。同时所用的标记抗体 与待测抗原比较是过量的。
• CA50——胰腺癌、肝癌、结、直肠癌、卵 巢癌、子宫癌、胃癌、肺癌、食道癌。 • CA19-9——对胰腺癌和胆囊癌诊断有较高 特异性，阳性率＞80%，绝对值升高明显。 • CA125——非粘液性卵巢癌诊断特异性强。 • CYFRA21-1——肺癌的诊断和疗效观察。
五 心血管疾病
• 内皮素（ET）
（二）特异性抗体
• a. 对特异性结合抗体的要求： • 1．亲和力 （affinity）高：指单个抗体分子与抗 原决定簇特异结合的能力，用 亲和常数Ka 值表 示，反映灵敏度，Ka应达109~1012mol/L。 • 2．特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待 测抗原类似物的结合能力（交叉反应率）低。 • 3．滴度 （效价）高：指将血清稀释时能与抗原 发生反应的最高稀释度。它反映抗血清中有效抗 体的浓度。稀释倍数越高，滴度(titer)越高，表 示抗体的效价越高。 • 4．稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳 定。
Ag+Ab*
Ag-Ab*+Ab* B F
• 由上式可见， IRMA不存在竞争反应，是待测抗 原直接与标记抗体反应。待测抗原的量与抗原标记抗体复合物的量成正相关关系。
1.单位点IRMA
• 单位点（one-site）IRMA是利用过量的标记抗体（Ab*） 与待测抗原（Ag）进行免疫结合反应，形成抗原标记抗体 复合物，当反应达到平衡后，再用固相抗原免疫吸附剂 （SP-Ag）与剩余的标记抗体结合，并将其分离。
四 肿瘤
• 甲胎蛋白（AFP）
• 甲胎蛋白作为一种肿瘤特异性抗原，对早期诊断原 发性肝癌具有较高灵敏性和特异性。阳性率在 60%~85%。
• 癌胚抗原（CEA）
• 癌胚抗原首先是从结肠癌和胚胎组织中提取的一种 肿瘤相关抗原，癌胚抗原升高和消化道肿瘤密切相 关。胃癌患者阳性率可高达50%以上。
• 糖类抗原（carbohydrate antigen， CA）
放射免疫分析技术的临床应用
• • • • • • 一 甲状腺疾病 二 代谢类疾病 三 骨和矿物质代谢 四 肿瘤 五 心血管疾病 六 器官移植中的药物监控
一 甲状腺疾病
• • • • • • TSH 促甲状腺激素 STSH 高灵敏度甲状腺激素 FT3 血清游离三碘甲状腺原氨酸 FT4 游离甲状腺素 TgAb 抗甲状腺球蛋白抗体 TmAb抗甲状腺微粒体抗体
临床上确诊为甲状腺功能亢进的步骤
STSH,FT3,FT4
STSH↓,FT3↑,FT4↑
STSH↓,FT3↑,FT4正常
STSH↓,FT3↑,FT4正常
确诊甲亢
摄131Ⅰ率
摄131Ⅰ率
摄131Ⅰ率
摄131Ⅰ率↑ 摄131Ⅰ率↓ 摄131Ⅰ率↑ 摄131Ⅰ率↓
摄131Ⅰ率↑或正常
摄131Ⅰ率↓
T4甲亢 （伴有甲肿）
• 骨钙素（OC）
• 骨钙素由成骨细胞合成，在合成过程中不断有少量 骨钙素释放到循环系统中，骨钙素的水平直接反映 骨骼生成状况，其检测可以帮助评价骨骼更新程度， 高水平的骨钙素与骨代谢病相关。 • 整分子骨钙素放免药盒（intact OC IRMA kit）可 以用于软骨病、Paget骨病、甲状腺功能亢进、肾 性营养不良、绝经后骨质疏松症的检测。
STSH,FT4
STSH↑,FT4↓
原发性甲低
有甲状腺肿
无甲状腺肿
抗甲状腺抗体阳性
抗甲状腺抗体阴性
抗甲状腺抗体阳性
抗甲状腺抗体阴性
桥本甲状腺炎
①激素合成障碍 ②药物引起（碘、锂） ③碘缺乏症（地甲肿）
抗甲状腺抗体阳性
①131I治疗后 ②甲状腺手术后或甲腺外照射 ③无甲状腺肿克丁病
二 代谢类疾病
• 胰岛素原（proinsulin）
病人服T3，（多无甲 肿）
T4甲亢 （伴有甲肿）
病人服T3，（多无甲 肿，FT4有时↓）
①毒性弥漫性甲肿（Graves 病） ②多结节甲肿（结节性甲亢） ③大的单个结节 （自主性结节甲亢）
有甲肿时多为： ①亚甲炎伴甲亢 ②碘致甲亢 ③甲状腺内转移癌伴甲 亢
无甲肿时多为医源性甲 亢
临床上确诊为甲状腺功能减退的步骤
2.双位点IRMA
• 将抗体1结合于固相表面，加入标本后，待测抗原与固 相抗体形成抗原-抗体复合物，并留在固相表面。洗去 其他物质后，加入标记抗体2，在固相表面形成抗体抗原-标记抗体复合物，再洗去多余标记抗体，即可达 到分离目的。
竞争性分析与非竞争分析的比较
第三章 放射免疫分析
放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用
第三章 放射免疫分析技术
体外放射分析技术
• 利用放射分析方法或其派生的相 关技术在体外进行体内物质种类 和含量的分析测定。
竞争性放射分析——放射免疫分析（RIA）
非竞争性放射分析——免疫放射分析（IRMA）
待测物质浓度与检测手段
临床化学分析
-12 10
pg/mL -9 10 -6 10 mg/mL -3 10 mg/mL -0 10 g/L
• 1,25二羟基维生素D及25羟基维生素D
• 体内维生素D经日光紫外线照射、且在C1和C25位 羟基化后，才能转变为有活性的维生素D代谢物。 • 测定血清中1,25二羟基维生素D及25羟基维生素D 的浓度可鉴别与维生素代谢有关的疾病。目前国内 用维生素D放免药盒用于维生素D缺乏症、骨营养 不良、肝炎和药物性维生素D紊乱、甲状旁腺功能 亢进或减退的测定。
• 正常生理条件下，胰岛素原分子释放很少，占 总分泌5%-10%，因此不考虑其对胰岛素测定 的影响。在病理情况下，如胰岛素瘤，血中胰 岛素原可达50%-70%。目前，市场上已有用 纯胰岛素原做为标准品的放免药盒，可用来直 接测定血清或血浆中的胰岛素原含量。
• 人真胰岛素(insulin specific)
• ET是一种内皮细胞来源的血管活性多肽，主要分
放射免疫分析法 （Radioimmunoassay，RIA）
• 1959年，Yalow和Berson创立了放射 免疫分析法（RIA），并因此于1977 年获得诺贝尔生物医学奖。 • 这种方法结合了放射性核素测量的 高灵敏性和免疫抗原-抗体反应的高 特异性两大特点，开创了生物活性 物质微量测定技术的先河。
女科学家 R.Yalow
基本原理
竞争结合：放射性标记的抗原（Ag*）和非 标记的抗原（Ag）在同一反应系统中与特异 性抗体（Ab）的竞争性结合。 Ag + Ab + Ag* Ag-Ab
Ag*-Ab
• 在上反应式中：
• Ag与Ag*的免疫活性相同，即 与Ab有相同的亲和力； • Ab的结合位点数＞Ag或Ag*， 但＜Ag+Ag*； • Ag*与Ab的量是恒定的，Ag是 待测量。
②B0为标准抗原浓度=0时的放射性值。
放免分析基本条件
• （一）标准抗原 • （二）特异性抗体 • （三）标记抗原 • （四）分离技术
（一）标准抗原
• a. 概念：是指已知真实含量，且不含对免疫反应 产生干扰杂志的抗原。 • b. 用途： • 免疫动物制备抗体——Ab • 放射性核素标记——Ag* • 绘制剂量反应曲线 • c. 要求： • 高纯度 • 高准确度 • 良好的稳定性
c.单克隆抗体的使用：
•
•
特异性高
亲和力低，不一定优于传统的多克隆抗
体
（三）标记抗原
• 对标记抗原的要求：
• 1．放射性比活度高：即单位物质的放射性强
度高，一般至少达到370GBq/mmol。
• 2．免疫活性：与标记前一致。
• 3．放射化学纯度高：应 > 95%。
• 4．稳定性好：标记的同位素不易脱落。
ng/mL
免疫分析
Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone
Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins
第三章 放射免疫分析
放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用
货架期短 以125I取代H，可能影响 免疫活性 标记方法简单，比活度高 γ射线测量效率高
对分离方法的要求：
• 1．使抗原-抗体复合物（B）与游离抗原（F）尽 可能分离完全； • 2．分离后便于放射性测量； • 3．分离效果不受外界干扰因素的影响； • 4． 操作简便、分离迅速、重复性好； • 5．与游离标记物的非特异性结合尽可能小； • 6. 试剂来源广泛、价格低廉。